ECL發(fā)光液使用說明

ECL 顯色原理：魯米諾在免疫測定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來。

產(chǎn)品描述：

ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒用于檢測直接或間接標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。其原理是，蛋白質(zhì)或核酸在電泳后轉(zhuǎn)移到印跡膜上，以一抗及HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合膜上的目的蛋白，或以HRP標(biāo)記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配制的ECL工作液，室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)小時，顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。

采用*的發(fā)光底物系統(tǒng)，降低曝光背景的同時引入新型的氧化劑，大大提高試劑盒的穩(wěn)定性，使其在室溫能穩(wěn)定放置一年。除用于X光片，還可直接使用熒光CCD掃描，主要用于WB檢測以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)。

優(yōu)勢:

   ● *靈敏度：可檢測低至10-100pg級的抗原

   ● *信噪比：優(yōu)化配方，背景很低

   ● *性價比：節(jié)省一抗和二抗，縮短實驗周期，降低經(jīng)濟(jì)和時間成本

   ● *穩(wěn)定性：持續(xù)發(fā)光時間長，4℃條件下保存時間可達(dá)6個月以上

   ● 可對X光膠片曝光，也可直接進(jìn)行l(wèi)uminometer檢測或者熒光CCD掃描。

試驗步驟：

   1. 執(zhí)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或者HRP標(biāo)記核酸探針孵育、洗膜。常溫操作即可。

   【注】：ECL發(fā)光液是HRP的顯色底物，因此檢測系統(tǒng)zui終必須基于HRP酶標(biāo)記抗體或者核酸探針。

   2. zui后一次洗膜的同時，新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的A液和B液1：1混合，混勻后，室溫放置備用。

   【注】：取A液和B液一定要用不同的槍頭；另建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。（100~200μl發(fā)光工作液/cm2膜）

   3. 用平頭鑷取出膜，膜的下緣輕觸在濾紙上除去多余洗液（勿使膜*干燥）。將膜*浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育1-3分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。

   【注】：孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行，也會導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小，但勿降低發(fā)光液使用比例。

   4. 用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜*干燥。

   5.將膜迅速包裹于潔凈的保鮮膜里，去除氣泡和皺褶，用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。

   6. 暗房內(nèi)取一張X光膠片至于包裹的膜上，壓片，分別曝光不同的時間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘，定影顯影沖洗。

   【注】：曝光時間需根據(jù)曝光強(qiáng)度做相應(yīng)的調(diào)整。若是背景過高，可使用兩張X光膠片同時壓片。

注意事項：

   1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

   2）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的干凈。

   3）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。

   4）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光，因此弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

   5）由于發(fā)光液靈敏度高，抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗，所以要適度優(yōu)化抗體濃度。

   6）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

   7）避免將多張膜置于同一個洗膜盒內(nèi)洗膜，相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。

   8）使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可確定膠片上條帶的位置和大小。

   9）使用生物素-親和素系統(tǒng)，避免使用牛奶封閉，可能會導(dǎo)致背景過高。

   10）金屬氧化物顆粒可能會造成膜上出現(xiàn)顆粒狀斑點，避免使用帶有銹跡的剪刀以及鑷子，建議使用塑料的平頭鑷子。

   11）*（NaN3）能抑制HRP活性，若回收HRP標(biāo)記探針或者抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。

   12）本品無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理。

愛必信特色產(chǎn)品線：

生化試劑（60萬種）、抗體（10萬種）、細(xì)胞因子、二抗、ECL發(fā)光液、蛋白marker、激動劑、抑制劑、凋亡試劑盒、BSA、動植物提取物、蛋白酶K...