抗原修復很重要，各種干貨快記牢！

做多了IHC實驗的小伙伴，相信對于抗原修復都不陌生，這看似簡單的一小步，往往會對IHC實驗產生顯著影響。愛必信作為您身邊的科研百寶箱，秉持著嚴謹認真的態度，為您總結了一系列從修復緩沖液、煮沸裝置到修復方法，注意事項的小技巧，希望這些小細節能完善您的實驗，像愛必信一直堅信的一樣，從小處入手，時刻陪伴您的科研生活，助力實驗大成功。

抗原修復是針對石蠟包埋的切片的必要步驟，大多數甲醛固定的組織在開始染色前都要先修復抗原，這是由于在固定過程中產生了亞甲基橋使蛋白之間交聯屏蔽了抗原位點。常用的兩種方法為熱修復法（HIER）和酶解法。

一、熱修復法

1. 熱修復緩沖液

適用于HIER的緩沖液有多種，我們推薦兩種常用的緩沖液：pH 6.0，10mM檸檬酸鹽緩沖液和pH 8.0，0.5mM EDTA緩沖液。具體使用哪種緩沖液可以參考您的抗體說明書，通常來講，EDTA緩沖液適合多數磷酸化酪氨酸特異性抗體，而檸檬酸鹽緩沖液則適用于其他多數抗體。

愛必信為您提供高品質的熱修復緩沖液：
 

2. 熱修復方法

(1)、高壓蒸汽法

▲ 將合適的抗原修復緩沖液加入高壓鍋內，然后將鍋置于加熱板并開至功率，此時不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中，進行脫蠟復水。
▲ 煮沸后，將玻片放入高壓鍋，蓋緊蓋子，小心燙傷。
▲ 高壓鍋達到壓力后，維持3分鐘。
▲ 3分鐘后，關掉加熱板，將高壓鍋取下放置。
▲ 釋放蒸汽，冷水冷卻鍋身。壓力下降后打開鍋蓋，冷水冷卻10分鐘。小心燙傷，修復完畢。

注意事項：

● 3分鐘只是建議時間，并不是所有抗原的修復時間，可以設置對照試驗，分別設定1、2、3、4……分鐘進行探索，確定修復時間。
● 確保玻片*冷卻再進行下一步實驗。

(2)、微波法

微波法不要使用家用微波爐，沒有高壓環境，修復時間長，會使切片解離。請使用科研微波爐。

向微波爐容器中加入合適的修復緩沖液
▲ 將玻片放入容器，置于微波爐內。將溫度設置在98℃維持20分鐘以修復抗原
▲ 20分鐘后，取出容器放置于水中冷卻10分鐘，小心燙傷，修復完畢。

注意事項：

● 要確保修復緩沖液足以浸沒玻片幾厘米，防止煮沸過程中變干。
● 20分鐘同樣也是建議修復時間，可設置對照試驗，自行探究修復時間。
● 確保玻片*冷卻。

二、酶解修復法

可依據抗體說明書選擇需要的酶，如果沒有，胰蛋白酶適用于大多數福爾馬林/PFA固定后需要修復的抗原。常使用的酶解修復方法有滴管法和浸泡法。

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(1)、滴管法

▲ 將胰蛋白酶預熱至37℃。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般50-100ul）。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個切片，注意不要弄壞組織

▲ 將玻片置于加濕器，然后37℃孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會因溫度不均影響染色質量。▲ 盛放玻片的容器先預熱再放入恒溫箱內。

▲ 10-20分鐘后，取出玻片，流水沖洗3分鐘。修復完畢。

(2)、浸泡法

將水浴溫度設置為酶適宜溫度。向盛放玻片架的兩個容器中加入超純水。容器放入水浴加熱。
▲ 將玻片放入水浴箱其中一個容器加熱
▲ 用水浴箱中另一個容器中的熱水制備抗原修復緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。
▲ 將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。

注意事項：

有些酶需要特殊緩沖溶液和活性輔助因子。
● 水或緩沖液體積要足夠沒過玻片
● 若將冷玻片直接放入酶溶液中會使溶液溫度降低從而酶活性降低，導致抗原位點修復不*。
● 盡可能快的準備出抗原修復緩沖液以避免妨礙酶活性的發揮。放入玻片之前使溶液達到需要的溫度。
● 10-20分鐘只是建議孵育實驗。可自行設置對照實驗探究孵育時間。