CHIR99021的實(shí)驗(yàn)參考方法介紹

　　CHIR99021（CHIR99021，CHIR 99021）是氨基嘧啶衍生物，是一種高效的GSK-3α（IC50：10 nm）和GSK-3β（IC50：6.7 nm）抑制劑，CHIR-99021對(duì)GSK-3的選擇性比接近的同源物CDC2、ERK2以及其他蛋白激酶高500倍以上。CHIR-99021激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的心肌向分化。

　　CHIR99021的實(shí)驗(yàn)參考方法介紹：

　　一、激酶測(cè)定

　　通過(guò)使用其His或Glu標(biāo)簽從SF9細(xì)胞中純化激酶。純化Glu標(biāo)記的蛋白質(zhì)，純化His標(biāo)記的蛋白質(zhì)。激酶測(cè)定在96孔板中用適當(dāng)?shù)碾牡孜镌?00μL反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行（50mM Tris-HCl，pH 7.5,10mM MgCl 2,1mM EGTA，1mM二硫蘇糖醇，25mMβ-甘油磷酸鹽，1mM的變化）NaF和0.01％牛血清白蛋白）。肽的Km值為1至100μM。將CHIR 99021或CHIR GSKIA加入3.5μLMe2SO中，然后加入ATP至終濃度為1μM。溫育后，將三份100μL等分試樣轉(zhuǎn)移至含有100μL/孔50μMATP和20mM EDTA的Combiplate 8平板。1小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗孔5次，填充200μL閃爍液，密封，30分鐘后在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。所有步驟均為室溫。抑制百分比計(jì)算為100×（抑制劑-無(wú)酶對(duì)照）/（Me2SO對(duì)照-無(wú)酶對(duì)照）。

　　MCE尚未獨(dú)立確認(rèn)這些方法的準(zhǔn)確性。它們僅供參考。

　　二、細(xì)胞分析

　　使用MTT測(cè)定法在暴露于不同濃度的GSK3抑制劑三天后測(cè)定小鼠ES細(xì)胞的存活力。MTT活性的降低是一種可靠的基于代謝的測(cè)試，用于量化細(xì)胞活力;這種減少與細(xì)胞活力的喪失相關(guān)。將2,000個(gè)細(xì)胞在含有LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的明膠包被的96孔板上接種過(guò)夜。第二天，將培養(yǎng)基更換為不含LIF且血清濃度降低的培養(yǎng)基，并補(bǔ)充0.1-1μMBIO，或1-10μMSB-216763，CHIR-99021或CHIR-98014。不含GSK3抑制劑或DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)基用作對(duì)照。所有測(cè)試條件一式三份進(jìn)行分析