類器官實操大本營之——固定包埋

收集生長至較大尺寸類器官：96孔板，生長密度較大時，使用移液槍取半孔以上，清洗1至3遍，洗去大部分基質膠，離心沉淀，棄除大部分上清。

1）稱量0.2至0.4g瓊脂糖，加入至燒杯或者小試劑瓶內；

2）加入10mL左右PBS；

3）微波爐高火融化，每隔5s暫停打開，觀察，重復數次至瓊脂糖融化；

4）取約200uL融化瓊脂糖，加入至600uL EP管內；

5）在盛有瓊脂糖的小EP管內插入一小PCR管，使瓊脂糖形成一圓尖底凹槽，室溫或者4℃冰箱靜置數分鐘，至瓊脂糖凝固，輕輕轉動小PCR管，取出PCR管，可看到瓊脂糖內形成一個深圓尖底槽。

1）將類器官輕輕吸出轉移至一固定槽底部；

2）輕輕加入PBS至高于瓊脂糖槽的邊緣；

3）蓋上蓋子，水平離心機1000 rpm，離心5min；

4）輕輕吸出除底部類器官沉淀外的PBS上清；

5）加入融化的瓊脂糖液體200μL；

6）室溫靜置至瓊脂糖凝固；

7）剪去固定管的底部和蓋子，置于2 mL EP管內，加入多聚甲醛至差不多裝滿整個EP管，置于4℃冰箱過夜。

1）脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊，在梯度乙醇中脫水，70%、80%、90%、95%乙醇各1h，100%乙醇30min,待其凝固。

2）融蠟：提前4h左右打開烘箱，65℃溶蠟。

3）透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中），將包埋盒轉移至二甲苯中5min處理兩次。

注：因二甲苯有毒性，需在通風良好區域進行操作，取出時盡量瀝盡殘留二甲苯。

4）浸蠟：透明化處理完成后立即轉入已經融化的蠟缸中，60℃浸蠟2h后，更換新的蠟缸再次浸蠟2h。

5）包埋：包埋在冰盒上進行，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置，然后再滴蠟包埋直到倒滿。待蠟塊凝固后，小心脫下模具。