類器官與PBMC共培養實驗方案，超實用！不信還學不會

最近很多寶寶問類器官如何跟PBMC共培養，這個實驗的關鍵點還是要先養好類器官，可以參照之前的類器官原代培養篇 “ 類器官原代培養全流程 "。

圖1 基質膠法構建類器官

那類器官培養成功的標準是什么呢？首先是我們培養的類器官需要穩定傳代3代以上，才能表示其干性是比較好的，其次就是要經過組化鑒定，觀察其和原組織形態和細胞類型上是否保持一致。經過鑒定后就可以進入我們下一步的實驗了，類器官組化的方法跟我們常規組織操作方法是十分類似的，區別就在于類器官的固定上，操作方法小愛也給大家整理好了。詳見“類器官實操大本營之——固定包埋"

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圖2 類器官組化鑒定

現在就進入我們共培養環節啦！

1、類器官準備

1）提前一周，復蘇培養類器官至狀態良好；

2）取合適數量類器官，使用預冷PBS清洗數次，去除大部分基質膠；

3）使用培養基重懸類器官。

2、PBMC分離和類器官共培養

1）外周血在無菌環境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集，運輸保存；

2）酒精消毒采血管表面，在生物安全柜內打開，將外周血轉入無菌15mL離心管；

3）使用Ficoll法分離PBMC；

4）PBMC計數，計算活力與與細胞數；

5）使用培養基（RPMI1640，10%FBS，1%雙抗，2mM谷氨酰胺，5ng/mL  IL-4與GM-CSF），懸浮調整至合適濃度，96孔板，每孔約加入5*105 活PBMC，100uL體積；

6）重懸類器官混合液，分別加入等量的樣至96孔板中，至總體積200uL。

3、培養觀察

1）D0觀察記錄細胞狀態；

2）37℃，5%CO2條件下培養，每日連續觀察；

3）D3吸出100uL培養上清，加入100uL新培養基，同時加入（處理抗體或藥物）使至終濃度100nM（如果D3已出現顯著差別，則記錄大視野明場形態，終止實驗）；

4）觀察至實驗組間差異顯著，拍照記錄大視野細胞明場形態；

5）細胞上清保存用于后續檢測。

此圖為我司做得免疫共培養實驗，從上圖可明顯看出B藥物作用下，T細胞有明顯的殺傷效果。

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