多重?zé)晒饷庖呓M化Q&A（第一彈）

更新時間：2023-04-20 點擊次數(shù)：1526

Q1：我想要進(jìn)行多色實驗，對于我的樣本有什么要求嗎？
A1：您按照免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)對您的樣本進(jìn)行前處理即可。如果是從歷史切片或者蠟塊中挑選用來做多色，請盡量選取相對較新的樣本（一個月內(nèi)），最長不要選保存超過半年的樣本，可能會有靶點缺失或者強非特異性，導(dǎo)致染色效果欠佳。

附上石蠟切片樣本處理推薦：

1）取新鮮組織（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的組織過大，需要切小后再做固定，以免組織太厚固定液滲透不良，導(dǎo)致后續(xù)染色效果不佳；

2）組織離體后（不要超過30分鐘）迅速轉(zhuǎn)移到固定液中（一般選用10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛），在常溫條件下固定時間為18-24小時，不要固定太長時間，容易導(dǎo)致組織抗原丟失，影響陽性信號顯色；

3）浸蠟溫度應(yīng)控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細(xì)胞收縮，容易導(dǎo)致后續(xù)染色過程中組織脫片；

4）切片厚度最佳為4微米，組織太厚容易導(dǎo)致染料滲透不加，且多層細(xì)胞之間熒光發(fā)生串?dāng)_，影響成像觀察。貼片需選用免疫組化專用的防脫載玻片，不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，撈片后豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴，不要用紙擦拭玻片；

5）切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右，到干片為止，否則后續(xù)染色過程中易脫片。但需要注意溫度過高或時間過長均會影響抗原的活性，因為在高溫干燥條件下會加速組織切片中抗原的氧化。

Q2：如果我的樣本是冰凍切片或者細(xì)胞爬片，可以用來做多色實驗嗎？
A2：可以的，多色實驗本身不局限您的樣本類型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否經(jīng)得起多輪抗體洗脫，在樣本不脫片的情況下，才能有一個比較好的染色效果。如果您是這類樣本，您需要額外準(zhǔn)備一瓶抗體洗脫液（abs994），替代多色實驗中的熱修復(fù)步驟，采用溫和的洗脫方式，避免高溫高壓破壞切片。需要注意的是，您依舊需要控制切片厚度，盡量保證在單層細(xì)胞的厚度，如太厚，多層細(xì)胞之間發(fā)生重疊，熒光信號會發(fā)生串?dāng)_。（PS：石蠟切片是比較適合做多色實驗的樣本類型！）

Q3：我該如何選擇用于做多色的抗體呢？
A3：多色這項技術(shù)比較突出的一個優(yōu)勢就在于對一抗種屬沒有特殊的限定，根據(jù)樣本種屬選擇即可，我們試劑盒本身配備了二抗（鼠兔通用二抗或者抗兔二抗），您在選取一抗來源的時候，盡可能選擇兔子或者小鼠來源的一抗，如確實找不到鼠或兔來源的一抗也沒有關(guān)系，您只需要再準(zhǔn)備一個跟該一抗來源適配的能用于免疫組化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能應(yīng)用于IHC，并且盡量選擇單克隆抗體，多抗往往容易產(chǎn)生非特異性。

Q4：我注意到你們多色試劑盒中也是熒光染料，我在操作過程中需要額外避光嗎？
A4：不用的，您在常規(guī)日光燈環(huán)境下操作就可以，我們?nèi)玖系臒晒鈴姸群芨撸粫敲慈菀状銣纾婕暗叫枰跤蛘弑４娴臅r候還是建議您采用避光濕盒進(jìn)行。

Q5：我今天做好了多色片子，但無法立即進(jìn)行掃描觀察，我該怎么保存呢？
A5：染好的多色片子可以避光在4℃條件下保存較長的時間，但我們建議您完成染色以后，在兩周內(nèi)完成成像，并且如果需要長時間保存，建議您用透明指甲油對蓋玻片邊緣進(jìn)行密封。如保存時間過長，或保存不當(dāng)，封片劑容易干掉，此時再成像會有較強非特異性，可以使用PBS把蓋玻片洗下來，重新封片以后再觀察，但成像效果依舊會打折扣，還是建議您盡快完成成像。（PS：雖然熒光染料沒有那么容易淬滅，但若多次成像反復(fù)激發(fā)，依舊會淬滅，2-3次影響不會很大，但不排除偶然性哦）

Q6：整個多色實驗一般需要多久能夠完成呀？一天能行嗎？
A6：如果您的指標(biāo)比較少（2~3個指標(biāo)），恰好您又是“肝帝"愿意熬夜做實驗，那么一天是可以做完的哦，因為我們多色染料有信號放大的功能，且試劑盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信號，因此原本需要4℃過夜的一抗孵育，可以在室溫1小時，或者37℃烘箱一小時完成，滿打滿算一天是可以做完實驗的。但如果您不想要這么“肝"，當(dāng)然可以，您只需要在一抗孵育的步驟選擇4℃過夜，第二天再來繼續(xù)做二抗孵育等后續(xù)操作就行，跟您做IHC實驗一樣，當(dāng)您指標(biāo)比較多的時候，可以合理安排，部分抗體室溫1小時，部分抗體4℃過夜，但也不可把“戰(zhàn)線"拉得太長，控制在盡可能短的時間完成實驗，畢竟遲則生變哦。

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人	小鼠
T細(xì)胞：CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45、CD103	T細(xì)胞：CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45
巨噬細(xì)胞：CD68、CD163、CD206、CD86	中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞：LY6G、CD11c、CD20、CD19
免疫檢查點：PD-1、PD-L1、HLA-DR、TIM-3、GZMB、CD24、LAG-3	巨噬細(xì)胞：F4/80、CD68、CD86、CD11b、CD163、M-CSF
成纖維細(xì)胞：α-SMA	腫瘤相關(guān)：SHP-2
腫瘤相關(guān)：Ki-67、PANCK、VEGF	白介素：IL-4、IL-10、IL-13
NK細(xì)胞：CD56	免疫檢查點：GZMB、PD-1、PD-L1
B細(xì)胞：CD20、CD19	NK細(xì)胞：NKR-P1C（NK1.1）
中性粒細(xì)胞：CD11c	信號通路相關(guān)：Arrestin-C、iNOS

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...