【W(wǎng)estern Blot】干貨！WB步驟及好物分享

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot ,WB），是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，探針是抗體，顯色用標(biāo)記的二抗。

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

Western blot操作繁瑣且環(huán)節(jié)眾多，實(shí)驗(yàn)人員無(wú)意中犯錯(cuò)的概率隨之增加，極大影響了其準(zhǔn)確性和重復(fù)性，就操作難度而言，WB在一眾實(shí)驗(yàn)中排名靠前，以下是WB步驟及好物分享。

一、試劑準(zhǔn)備

1）10x 電泳液：Tris Base 30.3g、Glycine 144g和SDS 10g，量取800ml ddH₂0，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，定容?L；
2）10x 電轉(zhuǎn)液：Tris Base 30.3g、Glycine 144g，量取800ml ddH20，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，定容?L；
3）1x 電泳液：10x 電泳液100ml，加水定容至1L；
4）1x 電轉(zhuǎn)液：10x 電轉(zhuǎn)液100ml，甲醇200ml，最后加水定容至1L；
5）10x TBS：Tris-base 60.6g、NaCl 87.66g，量取800ml ddH₂0，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，定容?L；
6）1x TBST：10x TBS 100ml加水定容至1L，加入吐溫1ml；
7）10% SDS溶液：SDS 10g，在100ml ddH₂0充分溶解，放于室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>
8）封閉液：脫脂奶粉5g，加入100ml 1x TBST溶解，配制成5%的封閉用牛奶。

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二、蛋白樣品制備

細(xì)胞總蛋白的提取

1）倒掉培養(yǎng)液，用移液槍吸干培養(yǎng)液；

2）每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，左右輕輕搖晃后棄去PBS。重復(fù)洗滌細(xì)胞三次；

3）按1ml RIPA裂解液加10ul PMSF（100mM），搖勻置于冰上；

4）每瓶細(xì)胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)；

5）裂解完后，用細(xì)胞刮片將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用移液槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中；

6）于4℃下12000rpm離心5min（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）；

7）將離心后的上清分裝至離心管中放于－20℃保存。

三、 蛋白含量的測(cè)定

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)樣品蛋白含量

推薦Absin BCA蛋白定量試劑盒（abs9232），按說(shuō)明書(shū)步驟嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

四、SDS－PAGE電泳

制膠

按順序加溶液制備分離膠，每加完一個(gè)溶液搖晃均勻，分離膠配好后用水封住，聚合至少需要40min。然后加入濃縮膠，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡，聚合需要30min，拔梳子時(shí)盡量避免拔歪。以上是傳統(tǒng)的制膠方法，不僅耗時(shí)而且耗力，在此推薦Absin的預(yù)制膠產(chǎn)品，幫您節(jié)約時(shí)間。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1）采用自動(dòng)化的灌膠生產(chǎn)技術(shù)，確保了產(chǎn)品質(zhì)量的高穩(wěn)定性和重復(fù)性；
2）采用玻璃膠板，有效減少蛋白非特異性吸附，使蛋白條帶更為敏銳，清晰；
3）膠夾打開(kāi)極為輕松，只需用刀片在膠夾一側(cè)輕輕劃一下即可打開(kāi)；
4）凝膠中不含SDS，可用于變性和非變性電泳；
5）兼容市場(chǎng)上主流的mini電泳槽，如Bio-Rad, Invitrogen, 天能和君意東方等；
6）本產(chǎn)品電泳時(shí)間短。本預(yù)制膠推薦的電泳電壓和電泳時(shí)間為150V 40-50min，即可完成電泳并獲得非常平整和銳利的電泳條帶。

五、上樣和電泳

1）樣品準(zhǔn)備：95℃加熱蛋白10min，快速震蕩離心，晾至室溫；
2）將膠板組裝在電泳儀器上，注意短的玻璃板朝電泳槽內(nèi)放置，要對(duì)齊夾緊不能漏水；
3）將電泳液從電泳槽中開(kāi)始加入，直至整個(gè)儀器全部充滿(mǎn)電泳液；
4）按照方案將蛋白和marker打入上樣孔中，marker 3ul即可；
5）蓋上蓋子，注意不要弄錯(cuò)方向，連接電源；150V 40-50min，即可完成電泳。

六、電轉(zhuǎn)

1）PVDF膜需要在甲醇中激活；
2）電泳結(jié)束后將膠板取出，短玻璃板朝上放置，揭開(kāi)短玻璃板后切除多余的膠，在水中將膠從長(zhǎng)玻璃板上取下；
3）在電轉(zhuǎn)液中，轉(zhuǎn)膜夾黑色面朝下，依次放置石棉網(wǎng)-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-石棉網(wǎng)，夾緊轉(zhuǎn)膜夾，注意PVDF膜要與膠貼合，排走氣泡。調(diào)整轉(zhuǎn)膜夾黑色界面轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)膜槽負(fù)極，白色面朝向轉(zhuǎn)膜槽正極。灌滿(mǎn)電轉(zhuǎn)液后，用200mA恒定電流轉(zhuǎn)膜120min（具體條件自行探索）轉(zhuǎn)膜槽外周裝滿(mǎn)冰塊。

七、封閉

1）將膜取出后，應(yīng)觀(guān)察到marker從膠轉(zhuǎn)移至膜上；
2）用TBST快速清洗掉膜上殘留的電轉(zhuǎn)液；
3）將PVDF膜浸泡在5%封閉牛奶中，緩慢搖蕩，室溫育1h。

八、抗體孵育和化學(xué)發(fā)光成像

1）封閉結(jié)束后，用1x TBST緩沖液洗掉多余的牛奶，洗膜每次5min，共3次。一抗使用一抗稀釋液或TBST按照1:5000稀釋?zhuān)ň唧w條件自行摸索）使用，然后將膜浸泡在一抗中，于4C冰箱中搖床解育過(guò)夜；
2）一抗孵育后并回收，加入1x TBST緩沖液放置于搖床上快搖5min，共3次。使用5%脫脂牛奶按照1:1000稀釋二抗，室溫慢搖1h；
3）二抗孵育完畢后，回收二抗，1x TBST快洗5min，共3次；
4）洗膜結(jié)束后，將發(fā)光液敷在膜上，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，采集并使用image J分析灰度。

好消息！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí)！

Absin特色產(chǎn)品線(xiàn)：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...