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                間充質干細胞鑒定手冊

                更新時間:2023-09-15      點擊次數:1068

                間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于中胚層的多能成體干細胞,廣泛存在于臍帶、骨髓、脂肪、牙髓、月經血等組織,體外培養可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種類型的細胞。


                圖1 The Mesengenic Process(圖片來源于文獻,僅供學習參考用)

                 

                MSCs具有自我更新能力和多向分化潛能,能夠釋放出許多具有抗凋亡、免疫調節、促血管生成等功能的生物活性因子,可刺激組織器官再生,并且低水平表達主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子,不表達MHC-Ⅱ類分子,不易激活T細胞的免疫反應,具有低免疫原性。這些特點和功能使MSCs成為細胞治療的選擇,美國臨床信息公示數據庫顯示,截止今年9月份,共有1583項MSCs的臨床實驗,研究主要集中于心血管疾病、骨關節損傷、自身免疫性疾病等。


                圖2 MSCs研究者分布和MSCs研究熱點

                 

                隨著MSCs的研究如火如荼,不同的分離方法、營養體系隨之而來,如何評判不同分離方法的MSCs獲得率成為了一個難題,為了解決這個問題,2006年,國際細胞治療學會的間充質和組織干細胞委員會提出了定義人類MSCs的標準。

                 

                1、MSCs在標準培養條件下必須具有塑料粘附性

                 

                MSCs具有異質性,不同物種,不同組織來源大小有所差異,例如貓脂肪來源MSCs臍帶來源MSCs小,所以無法單一的從外觀判定MSCs,但是幾乎所有的MSCs都是貼壁生長,具有較強的貼壁能力,多數MSCs呈纖維細胞樣生長,呈梭形或不規則三角形,胞質向外伸出突起。傳代后細胞呈旋渦狀排列生長。


                圖3 人骨髓間充質干細胞(圖片來源于網絡,僅供學習參考用)

                 

                2、特異性表面抗原(Ag)的表達

                 

                通過流式細胞術測量,95%的MSCs群體必須表達CD105、CD73和CD90。此外,這些細胞必須缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA II類的表達(5/2%陽性)。

                 

                表1 MSCs特異性表面抗原的表達指標

                Phenotype

                Positive (≥95%)

                Negative (≤ 2%)

                 

                CD105

                CD45

                 

                CD73

                CD34

                 

                CD90

                CD14或CD11b

                 

                 

                CD79a或CD19

                 

                 

                HLA II

                 









                3、在體外具有分化為成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞的能力

                 

                三系分化能力是MSCs特別的鑒定MSCs的方法,向成骨細胞的分化可以通過用茜素紅染色或von Kossa染色來證明,向脂肪細胞分化最容易通過油紅O染色來證明,成軟骨細胞分化通過阿利辛藍或免疫組織化學染色來證明。


                圖4 人MSCs成骨分化誘導 abs9453


                圖5 人MSCs成脂分化誘導 abs9454


                圖6 人MSCs成軟骨分化誘導 abs9455

                 

                三系分化小問答:

                 

                1、如何解決成骨分化后細胞極易脫壁的現象?
                1)試劑盒內含有包被液,可在鋪板前使用;
                2)分化時細胞匯合度不易過高,請按照說明書指示;
                3)多孔樣品換液時應盡量分批迅速,避免細胞表面干涸,加液時手法輕柔,不能直接沖擊皿底,換液時培養基必須復溫;
                4)誘導過程中更換培養液時不要清洗,誘導結束后清洗時一定要輕柔,避免劇烈晃動。


                2、成脂分化時細胞形態變差?
                1)成脂時細胞匯合度一定要達到90%左右;
                2)若用誘導培養基B時發現細胞狀態變差,可以根據具體情況提前更換為誘導培養基C;
                3)誘導過程中無需清洗,誘導結束后清洗時一定要輕柔,避免劇烈晃動。


                3、成軟骨誘導后軟骨球不懸浮或者軟骨球碎裂?
                1)細胞成軟骨誘導離心時,推薦220g離心5min,具體情況可以調整,以細胞聚團為準,離心力過大軟骨球不易懸浮,過小軟骨球表面易分散;
                2)誘導后24 小時內避免搖動細胞沉淀,以確保形成個團塊。離心管需使用聚丙烯材質無菌管;
                3)注意開關培養箱門時動作要輕柔,不要震動。


                4、軟骨球是否可以做冰凍切片?
                可以,做冰凍切片時固定后可以用蔗糖梯度脫水,若不及時切片染色,需用鋁箔紙包裹,保存在-80℃。

                 

                MSCs鑒定相關的講解就到這里啦,老師們有細胞培養相關問題,歡迎公眾號“愛必信生物"后臺留言。

                 

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                參考文獻


                [1] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.

                [2] Caplan A I, Correa D. The MSC: an injury drugstore[J]. Cell stem cell, 2011, 9(1): 11-15.


                 

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