干貨分享：細(xì)胞樣本如何做多色？

“你好，我的樣本是養(yǎng)的細(xì)胞，我還能做多色組化嗎？”

答案是可以！對(duì)于多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC）來(lái)說(shuō)，幾乎不挑剔樣本類(lèi)型，但需要攻克一個(gè)難題——多輪洗脫。傳統(tǒng)的組織樣本經(jīng)過(guò)前期處理固定包埋，再加上防脫載玻片的助力，在洗脫過(guò)程中，脫片概率相對(duì)小，即使有小部分脫落，但影響不至于很大；而細(xì)胞樣本，有可能在一張片子上，本身細(xì)胞數(shù)量就不多，如果還有脫落，可能最后“顆粒無(wú)收”。今天Absin分享的是細(xì)胞樣本做多色的方法，其中不能缺少的依舊是我們的“老演員”——抗體洗脫液（abs994）。

一、建議操作步驟：

1）樣本準(zhǔn)備：制備細(xì)胞樣本（細(xì)胞爬片、細(xì)胞涂片等），建議直接使用腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，方便后續(xù)檢測(cè)。完成制備后，用PBS簡(jiǎn)單漂洗（2×2min）；
2）細(xì)胞固定：用4%多聚甲醛常溫固定10-20min，PBS洗滌3×5min；
3）淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：滴加3% H₂O₂，室溫下孵育10-30min，PBS洗滌3×5min；
4）細(xì)胞通透（胞膜指標(biāo)省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100的PBS溶液，室溫下處理10min，PBS洗滌3×5min；
5）封閉：滴加封閉液（5%二抗同來(lái)源封閉血清或BSA），室溫孵育30min；
6）一抗孵育：棄封閉液，滴加稀釋好的一抗工作液，于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜或37℃ 1-2h（濕盒中可加少量水，防止抗體孵育過(guò)程干片），PBS漂洗3×5min；
7）二抗孵育：滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育20-50min，PBS漂洗3×5min；
8）染料孵育：滴加現(xiàn)配的1*TSA染料工作液（使用信號(hào)放大液按1:100稀釋?zhuān)磻?yīng)1-10min，PBS漂洗3×5min；
9）抗體洗脫：抗體洗脫液37℃預(yù)熱，甩去PBS后，滴加洗脫液浸潤(rùn)整個(gè)爬片，洗脫時(shí)間可控制在15-30min（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白＞胞漿蛋白＞胞核蛋白），PBS漂洗3×5min；
10）重復(fù)進(jìn)行步驟[5→9]，直到完成所有指標(biāo)染色；
11）滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒(méi)樣本區(qū)域，室溫孵育10min，PBS漂洗3×5min；
12）滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡；
13）掃描成像，數(shù)據(jù)分析。

二、注意事項(xiàng)：

1）若某些抗體難以洗脫，建議降低一抗稀釋比例，或?qū)⒃摪悬c(diǎn)排到最后一輪進(jìn)行染色；
2）抗體洗脫液在使用時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整孵育時(shí)間和洗脫溫度，若時(shí)間太長(zhǎng)有可能損傷抗原靶點(diǎn)以及細(xì)胞核形態(tài)；
3）若既有膜指標(biāo)又有胞內(nèi)指標(biāo)，可先做膜指標(biāo)，再做胞內(nèi)指標(biāo)，在進(jìn)行胞內(nèi)指標(biāo)染色之前再進(jìn)行打孔，若一開(kāi)始就打孔，可能影響胞膜指標(biāo)的染色；
4）由于細(xì)胞樣本可能存在的脫片問(wèn)題，可在開(kāi)始多色實(shí)驗(yàn)之前先模擬多次抗體洗脫的過(guò)程，多次使用抗體洗脫液洗脫與PBS漂洗，觀察細(xì)胞脫落情況，若明場(chǎng)不便觀察，可染一下DAPI再觀察；
5）上述操作步驟并不一定適合所有樣本和抗體，需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。

好消息！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí)！

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...