神經干細胞無血清培養(yǎng)指南——B27

概念——Mckay于1997年在《Science》雜志上將神經干細胞（neural stem cells，NSCs）的概念總結為：具有分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞，神經干細胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經細胞不能再生的傳統(tǒng)理論。

圖1 第3、5、7代神經球巢蛋白免疫熒光染色(×400)免疫熒光染色陽性圖片

特點——通過對稱分裂和不對稱分裂兩種分裂方式完成自我更新，NSCs具有多向分化潛能，且不表達成熟抗原，不被免疫系統(tǒng)所識別，能通過血腦屏障，可以與宿主的神經組織良好融合，在宿主體內長期存活。

應用——神經干細胞能夠趨向損傷部位，通過分泌神經營養(yǎng)因子或者分化為不同的細胞修復或補充受損神經組織，神經干細胞還可以作為基因載體，用于顱內腫瘤和其它神經疾病的基因治療，此外，體外培養(yǎng)的神經干細胞可用于判斷藥效及藥物毒性，例如觀察某些化合物的神經活性。目前美國臨床信息公示數據庫中，NSCs相關的臨床實驗共有122例，涉及到了多發(fā)性硬化、帕金森病、膠質母細胞瘤、脊髓損傷等。

不對稱分裂：一種細胞分裂的方式，母細胞產生的兩個子細胞的類型各不相同。相反，對稱性分裂就是產生兩個相同的細胞。

神經干細胞培養(yǎng)——許多研究表明采用無血清培養(yǎng)基，NSCs 可以穩(wěn)定在未分化狀態(tài)，而采用含血清培養(yǎng)基，NSCs 多數分化為神經元和膠質細胞。

B-27添加劑（50×，不含維生素A）abs9272是無血清添加劑，包含抗氧化劑、神經細胞所需生長因子、維生素（不含維生素A）和神經元所需的脂肪酸等，以適宜比例配比，可應用于大多數神經細胞培養(yǎng)。無維生素 A型可防止干細胞向神經細胞分化，是神經干細胞無血清培養(yǎng)不能少的試劑。推薦搭配神經元基礎培養(yǎng)基(abs9460)進行培養(yǎng)。 由于L-谷氨酰胺在水溶液中不穩(wěn)定，神經元基礎培養(yǎng)基和B-27中都未包含L-谷氨酰胺，因此在配制培養(yǎng)基時須另外添加L-谷氨酰胺。

圖2 不同類型培養(yǎng)基(×100)形成4d神經球的比較

A:無血清培養(yǎng)基含有B27(2%)原代培養(yǎng)4d；B:含血清培養(yǎng)基原代培養(yǎng)4d

培養(yǎng)基配置方案

1、置于4°C解凍本產品；
2、在使用前無菌添加2％本產品和5mM L-谷氨酰胺至神經元基礎培養(yǎng)基，配制成神經元培養(yǎng)基注意：剩余的本產品可以等分成工作體積，并儲存在-20℃。避免反復凍融；
3、對于原代海馬神經元培養(yǎng)，神經元培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補充25μM的L-谷氨酸，在培養(yǎng)4天以后不再額外添加谷氨酸。配置好的培養(yǎng)基，可于2-8℃的避光可保存一周。

圖3 B-27添加劑（50×，不含維生素A） abs9272

細胞培養(yǎng)步驟

1、用預冷的0.05mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)皿表，每平方厘米表面使用0.15mL，室溫包被1h；
2、去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗（多聚賴氨酸對細胞有毒性）。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)皿的蓋子通風，直到干燥。培養(yǎng)皿干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周；
3、根據標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經元或解凍凍存的原代大鼠神經元；
4、在預熱的（37℃）神經元培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備) 接種細胞，建議的細胞密度為160個細胞/平方毫米, 或必要時使用自行優(yōu)化的細胞密度；
5、在37℃，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)；
6、培養(yǎng)4-24h后, 更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
7、對海馬神經元以外的細胞：在接種4d后，更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基，之后每3d重復一次。 

對海馬神經元：接種3d后，用不含L-谷氨酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每3d重復一次。 

注意：在培養(yǎng)基中添加25µM 2-Mercaptoethanol，可改善海馬神經元的長期存活率。 

其他神經細胞培養(yǎng)添加物

除B27（50×，不含維生素A）外，含維生素的B27(abs9120)、N-2無血清添加劑(100×)(abs9121)，以及馬血清在神經細胞培養(yǎng)中的應用都較為廣泛。

區(qū)別在于：N-2無血清添加劑是化學成分確定的添加劑，N-2 添加劑主要被推薦用于神經母細胞瘤以及周圍神經系統(tǒng)(PNS)與中樞神經系統(tǒng)(CNS)來源的有絲分裂后期的神經元的生長和表達。B-27添加劑(50×)用于海馬神經元和其他中樞神經系統(tǒng)(CNS)神經元的生長和保持其短期或長期活性。其中不含維生素A款，可防止干細胞向神經細胞分化，更適合神經干細胞體外增殖。很早之前就有研究人員對比過不同種類血清對神經細胞培養(yǎng)的影響，結果發(fā)現(xiàn)相對于胎牛和其他動物血清，馬血清(abs989)促進神經細胞的增殖的作用顯著，與胎牛血清相比，馬血清用于培養(yǎng)神經細胞，具有非常高的性價比。

胞胞巴適本期推薦：

[1] 吳增,李媛,靳曉飛等.神經干細胞提取與培養(yǎng)方法的比較研究[J].中國藥理學通報,2018,34(05):729-734.

[2] 于麗華,趙書平,席先成等.不同種類血清對新生大鼠大腦皮層神經細胞培養(yǎng)的影響[J].實用醫(yī)藥雜志,2002(03):190-192.

注：文中圖片來自網絡或參考文獻，僅供學習參考用

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