干貨分享 | 腫瘤與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)方案

腫瘤微環(huán)境

癌癥的發(fā)生與腫瘤微環(huán)境有著密切的聯(lián)系，腫瘤微環(huán)境（Tumormicroenvironment，TME）是指腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和生活的內(nèi)環(huán)境，且具有異質(zhì)性，由腫瘤細(xì)胞及其募集的各種基質(zhì)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及相關(guān)細(xì)胞因子組成，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associatedmacrophages，TAMs），是TME中最重要的免疫細(xì)胞之一。

圖 瘤內(nèi)NK細(xì)胞缺乏豐富的膜突起

免疫細(xì)胞中的“臥底"——TAMs

殺傷腫瘤？

誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答？

No！No！No！

巨噬細(xì)胞可以根據(jù)其功能和活化作用分為兩種亞型：經(jīng)典活化的M1巨噬細(xì)胞和替代活化的M2巨噬細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮抗腫瘤、促進(jìn)免疫的作用，與經(jīng)典活化亞型相反，替代活化的M2巨噬細(xì)胞在促進(jìn)腫瘤生成、惡性腫瘤發(fā)生和免疫抑制中發(fā)揮作用，TAMs存在于在腫瘤的各階段，隨著腫瘤的進(jìn)展，M1型逐漸向M2型極化，早期以M1型為主，中晚期以M2型為主，M2型TAMs數(shù)量的增多也提示著預(yù)后不良。

為什么研究TAMs？

圖 2023年TAMs研究熱點(diǎn)

首先TAMs對(duì)不同類(lèi)型癌癥的生物學(xué)行為的影響尚未清晰，探究TAMs的作用機(jī)制有助于研究者們開(kāi)發(fā)以TAMs為靶點(diǎn)的腫瘤治療，腫瘤治療主要方式包括抑制腫瘤對(duì)TAMs的募集和消除腫瘤局部的TAMs，或者通過(guò)誘導(dǎo)TAMs表型轉(zhuǎn)化和削弱其促腫瘤功能，因此，近幾年有關(guān)TAMs的研究日益攀升。

TAM與癌癥相互作用的研究方式——共培養(yǎng)

共培養(yǎng)是指將兩種或兩種以上的細(xì)胞放在同一培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，來(lái)研究細(xì)胞間的相互作用。其優(yōu)點(diǎn)是可以模擬體內(nèi)環(huán)境，以便觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用，通過(guò)檢測(cè)不同細(xì)胞因子之間的關(guān)系，探討藥物作用機(jī)制和可能的作用靶點(diǎn)。常用的方式包括直接接觸共培養(yǎng)和間接接觸共培養(yǎng)，顧名思義，直接接觸式共培養(yǎng)將2種或2種以上細(xì)胞按照一定比例培養(yǎng)在同一培養(yǎng)皿中，適用于研究體內(nèi)鄰近組織細(xì)胞相互作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞分化。間接接觸式培養(yǎng)包括條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)法、爬片式共培養(yǎng)法和嵌入式細(xì)胞共培養(yǎng)法，今天主要為大家介紹條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)和嵌入式共培養(yǎng)兩種方法。

1、條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)法

所用試劑：PRMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基abs9484；胎牛血清abs972；青霉素-鏈霉素溶液abs9244；配制成含有10%FBS和1%雙抗的PRMI-1640培養(yǎng)基，PMA abs9107。

以THP-1和肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)為例：

1）選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好密度80-90%的THP-1細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后加入PRMI-1640培養(yǎng)基，THP-1濃度為5×10⁵個(gè)/mL；
2）加入100ng/mL PMA充分吹打混勻，鋪入六孔板置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h（具體濃度和作用時(shí)間可能因細(xì)胞狀態(tài)等因素有所差異），24h后棄掉上清液，PBS洗滌3次，加入1640培養(yǎng)基恢復(fù)24h；
3）取一皿生長(zhǎng)良好的肺癌細(xì)胞，PBS洗滌三次，加入1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含血清、含1%雙抗），培養(yǎng)24h，取上清液4℃ 3000rpm離心20min，離心后緩慢吸取上清加入10% FBS，吹打混勻，作為共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基，4℃可保存1周，或者-80℃冰箱保存半年；

4）細(xì)胞恢復(fù)24h，去掉上清，PBS洗滌3次，取一定量的共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基加入六孔板中（可設(shè)置梯度），補(bǔ)充1640培基至每孔2mL，共培養(yǎng)24h。

2、嵌入式共培養(yǎng)（Transwell小室）

Transwell小室是一類(lèi)小室底具有通透性膜的杯狀裝置，小室和培養(yǎng)板底部接種不同種類(lèi)的細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)將小室放入培養(yǎng)板從而建立細(xì)胞的共培養(yǎng)，Transwell小室也可用于趨化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)等。孔徑分為0.4μm、3μm、5μm、8μm，小于3μm孔徑的小室，細(xì)胞不能遷移通過(guò)，適用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。膜材質(zhì)分為PC和PET，PC膜為半透明，PET膜透明，PET更方便在顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)。

圖 細(xì)胞小室

所用試劑：PRMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基abs9484；胎牛血清abs972；青霉素-鏈霉素溶液abs9244；配制成含有10%FBS和1%雙抗的PRMI-1640培養(yǎng)基，PMA abs9107；細(xì)胞小室（PET膜，24mm，孔徑0.4um，含6孔板）abs7270。

1）選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好密度80-90%的THP-1細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后加入PRMI-1640培養(yǎng)基，THP-1濃度為5×10⁵個(gè)/mL；
2）加入100ng/mL PMA充分吹打混勻，鋪入六孔板置于5% CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h（具體濃度和作用時(shí)間可能因細(xì)胞狀態(tài)等因素有所差異），24h后棄掉上清液，PBS洗滌3次，加入PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%左右，收集M0巨噬細(xì)胞；
3）將培養(yǎng)小室置于6孔板上，上層加入癌細(xì)胞，下層加Ｍ0型巨噬細(xì)胞，兩種細(xì)胞均勻分布于各層培養(yǎng)48h，細(xì)胞比例因癌細(xì)胞種類(lèi)有所不同。

共培養(yǎng)過(guò)程中可以觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化。

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本期推薦：

注：本文圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用

[2] 孟凡榮.巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移能力的影響[D].天津醫(yī)科大學(xué),2018.

[3] Xiang W, Shi R, Kang X, et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2574.

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