免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP) 磁珠法VS瓊脂糖珠法

免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP)

是基于抗體和蛋白的特異性親和作用，通過捕獲與蛋白或抗原特異性結合的抗體，進而從復雜的樣品中捕獲及富集目標蛋白，同時可以測定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子的一種技術。

瓊脂糖珠VS磁珠

瓊脂糖珠作為免疫沉淀實驗中的固相支持物已經歷經多年，隨著實驗技術的發展，磁珠開始大幅取代瓊脂糖珠，成為免疫沉淀純化方法的首先選擇，許多剛接觸的研究者都要面臨方法選擇的問題，磁珠法VS瓊脂糖珠法，區別在哪里？分別有什么優缺點？

圖1 瓊脂糖珠結構

圖2 磁珠

區別：

1、抗體結合量：瓊脂糖珠（直徑50-150μm）明顯大于磁珠（直徑1-4μm），所以單個瓊脂糖珠結合抗體的量大于磁珠，但是磁珠每體積的磁珠比瓊脂糖珠的量多；
2、結合能力：瓊脂糖珠是多孔的海綿狀結果，與抗體的結合能力優于磁珠；
3、非特異性結合：瓊脂糖珠的非特異性結合比磁珠多，樣品中的非目的蛋白或者抗體的任何部位都可能與之結合，所以在瓊脂糖珠法中，樣品的預處理非常重要；
4、抗體的損耗：瓊脂糖珠大于磁珠，由于瓊脂糖珠的多孔結構，抗體很容易被困其中，并且，離心洗滌的過程中很容易流失；
5、實驗時間：磁珠法可室溫短時間孵育（僅限Absin abs9649和abs955的比較）；
6、特殊設備：磁珠法需要自備磁力架。

abs9649（磁珠法）和abs955（瓊脂糖珠法）常見問題：

圖 abs9649免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒(磁珠法)

圖 abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒

以下問題僅針對愛必信現有兩款試劑盒abs9649和abs955

一、樣品處理

1、兩個試劑盒中lysis buffer都要添加PMSF嗎，怎么使用？

兩個試劑盒中的PMSF都要額外準備，推薦abs9146，根據使用量，取每1mL lysis buffer加入10ul PMSF（100mM，溶解174mg的abs9146于足量的異丙醇中，定容到10mL，分裝成小份貯存于-20℃。）使PMSF的最終濃度為1mM，混勻備用 （PMSF現用現加）。磁珠法緩沖液請按說明書配置后使用，buffer稀釋均可用超純水。

2、abs9649如果沒有超聲破碎儀的話，能不能用酶解的辦法破碎細胞？

酶解和超聲都可以，酶按照實驗室正常使用濃度配制即可。

3、蛋白的量如何估算？

可以使用BCA蛋白定量試劑盒(abs9232)。

4、如果我的細胞裂解物里面蛋白含量高于試劑盒要求的總蛋白含量，我應該用什么試劑進行稀釋呢？

常規用PBS稀釋即可。

二、如何減輕瓊脂糖珠非特異性吸附？

可以通過多次洗滌，和樣品預處理（適當延長Protein A和Protein G的孵育時間）來降低背景，但應注意，選擇此步驟后，試劑盒中protein A和protein G對應實驗樣本數減半。

三、結合過程中，4℃混合過夜孵育可用什么儀器？

可以用混合儀abs72030或abs72019。

圖 abs72019旋轉混合儀(XHE-100)

四、abs955中beads出現吸不出來的情況，怎么處理？

吸之前需注意槍頭要剪一下再吸，如若beads吸不上來，可加入等體積的20%乙醇混勻后再吸。

五、如果我后續是想要跑native膠，不做變性電泳，如何選擇樣品緩沖液？

用不含有SDS的WB上樣緩沖液，但不經過變性，蛋白能否解離下來，我們無法確定，不能保證您后續的實驗效果。

六、磁珠法兩種洗脫方案的區別？

兩種洗脫方案均包含捕獲抗體及目的抗原，低pH 洗脫樣本中抗體為完整結構，變性洗脫樣本中抗體解離為重鏈、輕鏈，請根據后續實驗需求選擇洗脫方案。

*文中圖片來源于網絡，僅供學習參考用

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