流式輔助產(chǎn)品使用指南

簡(jiǎn)述：

流式細(xì)胞術(shù)是一種基于熒光的檢測(cè)的技術(shù)，能同時(shí)測(cè)定懸浮于溶液中的單個(gè)細(xì)胞的多種特性，例如細(xì)胞群計(jì)數(shù)和蛋白豐度。流式細(xì)胞術(shù)使用熒光偶聯(lián)抗體直接檢測(cè)抗原，每種抗體對(duì)應(yīng)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面的不同蛋白，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特性的快速、定量和準(zhǔn)確測(cè)定，并且提供針對(duì)細(xì)胞群異質(zhì)性的解讀，主要優(yōu)勢(shì)在于，它可以同時(shí)分析細(xì)胞群中的多個(gè)參數(shù)和多個(gè)不同的細(xì)胞標(biāo)志物。

圖1 流式示意圖

樣本處理：

針對(duì)流式細(xì)胞分析進(jìn)行的樣品制備是一個(gè)關(guān)鍵步驟，樣本制備的好壞對(duì)最終的檢測(cè)結(jié)果有很大的影響。常見(jiàn)的的樣本多為外周血、骨髓、腦脊液、胸水、腹水以及淋巴結(jié)、脾、肝等，不同類型的樣本最好在12h內(nèi)進(jìn)行處理，若無(wú)法及時(shí)處理，4℃保存，保存時(shí)間因樣品而異，最好不超過(guò)48h。

圖2 血液成分

以人的血液為例：

1、樣本收集后置于含抗凝劑（一般選擇肝素或EDTA）的試管中；

2、在15mL無(wú)菌離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液(abs930) 5mL；（注意：淋巴細(xì)胞分離液使用前需恢復(fù)室溫，18-25℃）

3、Hank's液 (abs9257)或PBS緩沖液(abs962) 1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當(dāng)增大比例）稀釋抗凝過(guò)的全血樣品；

4、小心沿著壁管，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過(guò)的4mL全血樣品在淋巴細(xì)胞分離液上面；（注意：切記不要攪渾淋巴細(xì)胞分離液）

5、小心放進(jìn)離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子），4℃離心20-30min，速度為400g-1000g；（注意：離心機(jī)剎車應(yīng)取消，需等待自然停止）

6、取出離管，切記不要震動(dòng)。可見(jiàn)上層為淡紅色透明血漿，其次為薄薄的只密白色環(huán)，白色環(huán)衛(wèi)單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞；

7、棄上層，吸出PBMC層，加入PBS，洗1-2次。300g，10min，離心去上清，加入抗體進(jìn)行染色。

圖3 abs930人淋巴細(xì)胞分離液

腦脊液、胸水、腹水等體液：

1、樣本收集至抗凝管中，室溫或4℃保存；

2、樣本1000-1500rpm離心5min，棄去上清；

3、加入含有0.1%牛血清白蛋白的PBS，1000-1500rpm離心5min進(jìn)行洗滌；

4、加入適量PBS重懸。如有細(xì)小沉淀，用40um細(xì)胞篩網(wǎng)（300目，藍(lán)色） abs7231過(guò)濾后備用。

淋巴結(jié)、脾、肝等組織：

組織樣品比較常用酶消化和機(jī)械破碎的方法處理成單細(xì)胞懸液。程序參照細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞的制備，注意可用800-1000rpm 低速離心3min去除細(xì)胞碎片的影響。

封閉(abs9476)或(abs9477)

D16是低吸附的IgG FC受體 III(FcR III)，CD32是FC受體 II(FcR II)，CD16/CD32表達(dá)于B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（低水平）、Kupffer細(xì)胞、未成熟胸腺細(xì)胞和某些活化的成熟T淋巴細(xì)胞。FcR表達(dá)細(xì)胞在免疫熒光染色中有時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，原因在于FcRs介導(dǎo)的Ig Fc結(jié)合性。

為阻斷Fc受體，100µL染色體積按照每10⁶個(gè)細(xì)胞加入0.25µg小鼠Fc受體阻斷劑，混勻，冰上孵育5-10min，之后用抗體進(jìn)行染色。在此封閉和免疫染色步驟之間沒(méi)有必要進(jìn)行細(xì)胞清洗。

固定(abs9110)、破膜(abs9111)

1、收貨待測(cè)細(xì)胞（流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，一般的細(xì)胞量就是控制在5*106-107個(gè)cell/mL； 做流式每管的細(xì)胞量可取100uL），1000rpm離心10min，棄上清；
2、加入500uL 4℃預(yù)冷的固定劑；
3、室溫避光孵育10min；
4、1000rpm離心10min；
5、棄上清，加入PBS洗一次，1000rpm離心10min；
6、棄上清，加入1.5mL破膜劑；
7、室溫孵育10-15min；
8、1000rpm離心5min；
9、棄上清，加入適量（100uL左右）破膜劑（注意加入的是破膜劑而非PBS）重懸細(xì)胞；
10、加入檢測(cè)抗體染色后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞常見(jiàn)問(wèn)題

1、所有樣本在檢測(cè)之前都需要固定嗎？

我們一般在檢測(cè)胞內(nèi)指標(biāo)時(shí)需要固定破膜，特殊情況下，染完胞膜指標(biāo)已經(jīng)到很晚，可以對(duì)樣本進(jìn)行固定處理，4℃放到第二天檢測(cè)，保持檢測(cè)指標(biāo)的穩(wěn)定性（如果染色的抗體顏色是耦聯(lián)染料（PE-Cy5、PE-Cy7、PerCp-Cy5.5）不能固定，因?yàn)轳盥?lián)染料在固定時(shí)會(huì)解偶聯(lián)，這會(huì)導(dǎo)致熒光染料降解。），當(dāng)樣本特別多的時(shí)候，間隔會(huì)很久，這種情況下上機(jī)前也可以做一下固定，保持前后數(shù)據(jù)的一致性，此外，在蛋白翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、甲基化等的研究過(guò)程中，固定劑可以固定住翻譯后修飾的位點(diǎn)，也可以防止目標(biāo)位點(diǎn)在活細(xì)胞中很快降解。

2、細(xì)胞染色緩沖液(abs9475)和pbs相比有什么優(yōu)點(diǎn)？

staining buffer是一種緩沖鹽水溶液，可用作抗體和細(xì)胞稀釋步驟，以及細(xì)胞表面染色和流式細(xì)胞分析的所有清洗步驟，含胎牛血清，減少抗體和熒光素對(duì)目的細(xì)胞的非特異性結(jié)合；還含疊氮鈉，是一種代謝抑制劑，能抑制細(xì)胞表面抗原的成斑和成帽現(xiàn)象。

成斑和成帽現(xiàn)象：在熒光免疫標(biāo)記試驗(yàn)中，兩種膜蛋白熒光抗體混合后，由于膜蛋白的流動(dòng)性，一段時(shí)間后，兩種熒光蛋白抗體均勻分布在質(zhì)膜上。時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，抗體在細(xì)胞表面會(huì)重新分布，聚集在細(xì)胞的一定部位即所謂的成斑現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，二價(jià)抗體在細(xì)胞膜表面相互交聯(lián)使被標(biāo)記的膜蛋白集聚在細(xì)胞的一端，即成帽現(xiàn)象。

3、用了Fc受體阻斷劑還需要做同型對(duì)照嗎？

同型對(duì)照抗體相當(dāng)于沒(méi)有特異靶標(biāo)的一抗作用是排除非特異性結(jié)合，包括：抗體與靶細(xì)胞上的 Fc受體結(jié)合；抗體與細(xì)胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結(jié)合和。但是有很多種細(xì)胞的FC受體能結(jié)合FC段（表達(dá)DC64，CD32，CD16的細(xì)胞結(jié)合力較強(qiáng)），同型抗體能與FC受體結(jié)合，但是結(jié)合能力和一抗是一樣的，

抗體與細(xì)胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結(jié)合，F(xiàn)c受體阻斷劑解決不了，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中有些抗體較難找到同型抗體。而且，F(xiàn)c受體阻斷劑相對(duì)比較便宜，是比較好的選擇。

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