干貨 | 不同類型樣本RNA提取選擇指南

背景

核糖核酸(RNA)是生命科學(xué)“中心法則"的三大核心分子之一，它主要以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，轉(zhuǎn)錄形成的一條單鏈分子。RNA的主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá)，是遺傳信息傳遞過(guò)程中的橋梁。

圖 中心法則

RNA根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，又可以分為mRNA、rRNA、tRNA以及一些小分子RNA等。

表1 不同種類RNA

RNA提取

核酸提取在核酸分子檢測(cè)領(lǐng)域是及其關(guān)鍵的一步。對(duì)于RNA提取方法研究，具有較為悠久的發(fā)展歷史，形成了多種總RNA提取方法，如異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法（Trizol抽提法）、堿裂解法、柱層析法、磁珠法等。

1）柱層析法：通過(guò)特殊的硅膜柱吸附RNA，通過(guò)洗脫實(shí)現(xiàn)RNA的提取。這種方法操作簡(jiǎn)單、核酸提取得率高，是目前實(shí)驗(yàn)室常用的RNA提取方法；

2）磁珠法：采用吸附RNA，通過(guò)磁場(chǎng)來(lái)分離RNA。這種方法操作簡(jiǎn)單，且可以實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)核酸提取，非常適合大批量RNA提取。

各種提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)不同樣本類型以及實(shí)驗(yàn)需求來(lái)選擇。

愛必信明星產(chǎn)品Trizol(abs60154)是基于異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法的細(xì)胞或組織總RNA抽提試劑，對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞或組織及細(xì)菌的總RNA抽提均適用。提取所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值為1.8-2.0，同時(shí)可以保持樣本中RNA的完整性，適用于多種下游實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)

1）操作簡(jiǎn)單快速；
2）能抽提多種屬總RNA；
3）能抽提不同分子量大小的多種RNA；
4）能夠避免DNA和蛋白的污染；
5）RNA得率高、純度高；
6）抽提出來(lái)的RNA適用于多種實(shí)驗(yàn)。

圖 Trizol(abs60154)引用文獻(xiàn)展示

經(jīng)常會(huì)有客戶來(lái)咨詢是否能用Trizol進(jìn)行血液RNA提取，本期給大家介紹下以Trizol法提取血液樣本RNA實(shí)驗(yàn)操作。

實(shí)驗(yàn)原理

Trizol試劑是一個(gè)包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細(xì)胞的同時(shí)抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會(huì)大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA則分布在上層的水相中，最后用異丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗滌沉淀，這樣就可以得到比較純凈的總RNA。 

圖 Trizol提取RNA流程圖

實(shí)驗(yàn)步驟

1、所需試劑、耗材設(shè)備

Trizol(abs60154)、無(wú)酶無(wú)菌水(abs9259)、氯仿、異丙醇、75%乙醇、無(wú)菌無(wú)酶離心管(abs7119)、無(wú)菌無(wú)酶吸頭(abs7072、abs7075、abs7081)、低溫離心機(jī)

1）取300-500μL新鮮全血加入裝有1mL Trizol的2mL離心管中（樣品體積一般不超過(guò)Trizol體積的10%），充分吹打均勻；
2）室溫靜置5min，使核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物分離。（此時(shí)的樣品可在-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存）；
3）每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min；
4）4℃ 12000xg離心15min，樣品會(huì)分成三層：桔黃色的下層有機(jī)相，中間層和無(wú)色的上層水相；
5）吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所加Trizol試劑的60％；
6）按照每1mL Trizol的最初使用量加入0.5mL異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置10min；
7）4℃ 12000xg離心10min，棄除上清，可見膠狀的RNA沉淀；
8）按照每1mL Trizol的最初使用量加入1mL 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀；
9）4℃ 12000xg離心5min，棄除上清；
10）室溫倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機(jī)，以免RNA過(guò)干，難以溶解）；
11）加入適量（如25uL）無(wú)酶無(wú)菌水(abs9259)或TE緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解RNA；
12）所得的RNA應(yīng)立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

注：對(duì)于其他樣本如動(dòng)植物細(xì)胞、組織、酵母細(xì)胞以及細(xì)菌請(qǐng)參考愛必信說(shuō)明書

2、RNA質(zhì)量檢測(cè)方法

為了保證下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，需要對(duì)提取好的RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。一般需要檢測(cè)RNA純度、濃度、完整性。

3、RNA濃度檢測(cè)

可以使用NanoDrop超微量分光光度計(jì)和Qubit系列熒光計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度。使用分光光度計(jì)檢測(cè)可以記錄各RNA樣品的濃度及OD260/OD280、OD260/OD230的比值。RNA的濃度是衡量所提取的RNA質(zhì)量高低的重要標(biāo)準(zhǔn)，若RNA的濃度較低，則影響后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)。

4、RNA純度檢測(cè)

RNA的OD值是衡量RNA純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)，較為理想的總RNA的OD260/OD280比值應(yīng)為1.8~2.1，當(dāng)OD260/OD280的值小于1.8時(shí)，說(shuō)明RNA中存在較多的污染，這種污染可能是蛋白質(zhì)或者其他雜質(zhì)。當(dāng)OD260/OD280的值大于2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已部分降解。OD260/OD230的值作為參考，一般大于2.0較好。若OD260/OD230的值低于2.0，則說(shuō)明提取的RNA有污染，這種污染一般來(lái)自蛋白質(zhì)、鹽類或次生代謝物。

5、RNA完整性檢測(cè)

取提取的RNA樣品5µL，與1µL 5×RNA Loading Buffer混勻后，在100-120V電壓條件下，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳30min。電泳結(jié)束后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢查RNA電泳條帶的完整性。

瓊脂糖凝膠電泳條帶的質(zhì)量是評(píng)估提取的總RNA完整性快捷的方法，一般電泳條帶的亮度與提取的RNA濃度成正比。對(duì)于真核生物樣品，完整的總RNA在進(jìn)行變性凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S和18S rRNA條帶，兩條帶的亮度比約為2:1，并且可以觀察到5S rRNA條帶。

圖 總RNA電泳結(jié)果

其他RNA提取產(chǎn)品

為了滿足不同客戶分子實(shí)驗(yàn)需求，愛必信研發(fā)有針對(duì)不同樣本如動(dòng)植物組織和細(xì)胞、血液、病毒、微生物的RNA提取試劑盒，同時(shí)進(jìn)行了RNA提取方法學(xué)區(qū)分。我們擁有的優(yōu)勢(shì)有：

1）產(chǎn)品種類豐富；
2）產(chǎn)品安全性高；
3）RNA提取純度高；
4）RNA提取得率高；
5）操作簡(jiǎn)便快捷；
6）專業(yè)售前售后技術(shù)支持。

對(duì)于特殊、珍貴樣本，我們建議選擇用針對(duì)不同樣本類型的專項(xiàng)試劑盒。可以根據(jù)以下表格指南進(jìn)行選擇。

表 RNA提取試劑盒選擇指南

好消息！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí)！

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...