微生物平板計數(shù)法和流式檢測法介紹

食品安全的重要性不言而喻，而微生物檢測是食品安全檢驗的重要組成部分。在進行微生物檢測時，首先要根據(jù)其性質(zhì)和特點，選擇適合的微生物檢驗方法，同時還要明確食品的污染狀況、危害程度以及具體的檢驗項目和要求。

微生物檢測方法包括常規(guī)檢測法（如平板計數(shù)法、涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗、血清學(xué)試驗等）、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、代謝學(xué)技術(shù)等。本期小愛向大家介紹2種常用的微生物檢測方法：平板計數(shù)法和流式檢測法。

1、平板計數(shù)法

微生物平板計數(shù)常用3種培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏 (Gause)Ⅰ號培養(yǎng)基和Martin瓊脂培養(yǎng)基。針對食品微生物檢測常用培養(yǎng)基的配制，應(yīng)當根據(jù)不同檢驗?zāi)康模x擇不同的配制材料，常見的培養(yǎng)基材料配比如表1。在實際食品微生物檢驗過程中，根據(jù)不同的需要對配制材料進行選擇。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：主要用于食品微生物中細菌的培養(yǎng)。為保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，需要在125℃環(huán)境下持續(xù)進行15min的滅菌處理。

高氏 (Gause)Ⅰ號培養(yǎng)基：主要用于放線菌的培養(yǎng)。在配制的過程中，首先應(yīng)當在淀粉中添加少量的冷水，通過攪拌得到糊狀淀粉后，再將其倒入100℃的水中，然后加熱并加入其余配制材料攪拌至溶化。配制后同樣需要在125℃環(huán)境下持續(xù)進行15min的滅菌處理。

Martin瓊脂培養(yǎng)基：主要用于微生物中真菌的分離，完成滅菌處理后，在使用前加入0.02%鏈霉素稀釋液，通常為100~150mL，保證每毫升培養(yǎng)基當中均含有25μg鏈霉素。

表1  73種常用培養(yǎng)基材料配比^[1]

然而，平板計數(shù)法時效性不足、難以區(qū)分死活、無法檢測非培養(yǎng)性微生物。微生物活的非可培養(yǎng) (Viable but non-culturable，VBNC) 狀態(tài)（圖1）給平板計數(shù)法帶來了挑戰(zhàn)，同時也吸引了越來越多學(xué)者的關(guān)注。流式細胞術(shù)可解決平板計數(shù)法檢測不到VBNC狀態(tài)菌的問題。

圖1 VBNC狀態(tài)的形成與復(fù)蘇

2 、流式檢測法

微生物的流式細胞儀檢測也是科學(xué)研究中比較常用的檢測技術(shù)。與真核生物細胞相比，細菌等微生物的體積較小，其散射光難以與其他物質(zhì)的顆粒區(qū)分。因此，通過流式細胞儀的檢測依賴于與細胞結(jié)合的熒光染料，用于從背景中識別真正的目標物。

A：液流系統(tǒng)；B：光源系統(tǒng)；C：檢測和計算、分析系統(tǒng)

圖2 流式細胞儀的組成及工作原理^[2]

根據(jù)熒光底物的不同，適用于流式檢測法的熒光染料主要包括：結(jié)合核酸的染料，如PI、7-AAD；標記抗體蛋白的染料，如Cy5、FITC、PE。不同的熒光染料具有不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長。流式細胞儀通常會配備多個激光器，如405nm、488nm、633nm 等。多激光器可實現(xiàn)多熒光通道分析，減少自發(fā)熒光干擾、減少熒光信號之間的補償，提高檢測靈敏度。

表2 微生物流式檢測常用染料

另外，流式細胞術(shù)熒光標記的選擇還需考慮儀器配置的光源波長、染料的亮度與靶標表達量的匹配、染料光譜重疊和樣本自發(fā)熒光等多重因素。

3、7-AAD流式檢測原理及方法

7-AAD是一種核酸染料，它在細胞凋亡和細胞死亡過程中會被釋放出來。當細胞開始凋亡時，其質(zhì)膜對7-AAD的通透性會逐漸增加。在特定的波長激發(fā)下，7-AAD可以發(fā)出明亮的紅色熒光。通過這種熒光的強度，可以將細胞分為三個群體：7-AAD信號強的代表死亡細胞，7-AAD信號弱的則是處于凋亡狀態(tài)的細胞，而沒有檢測到7-AAD信號的是正常活力的細胞。

該操作步驟適用于大多數(shù)細胞，但不同的細胞類型、細胞密度、使用的培養(yǎng)基以及其他一些因素都有可能影響染色效果以下步驟僅供參考。

1）儲存液的制備：取適量DMSO加入到7-AAD原瓶中配制成1-10mM儲存液，分裝保存于-20℃，可穩(wěn)定保存6個月；
2）根據(jù)自身樣本選擇合適的步驟固定細胞。7-AAD染色一般在其它染色完成后再進行，且僅僅染色死細胞；
3）離心收集細胞，并用合適的的緩沖鹽溶液或者培養(yǎng)基（pH=7.4）重懸細胞；
注：貼壁細胞可在蓋玻片或者培養(yǎng)板上進行原位染色。
4）加入適量7-AAD染色液，推薦該染料的工作濃度為0.5-5µM，孵育15-60min；
注：實驗建議在推薦的工作濃度范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度檢測，從而摸索最佳的染色濃度。
5）根據(jù)其最大激發(fā)和發(fā)射波長（Ex/Em=545nm/650nm）在流式細胞儀下（FL3通道）檢測熒光強度。

圖3 用0.25μg/10⁶ cells 7-AAD復(fù)染，流式檢測計算細胞死亡率^[3]

[1] 吳芳媛,馮秋芳,林黎.食品微生物檢驗常用培養(yǎng)基配制,滅菌及貯藏研究[J].食品安全導(dǎo)刊, 2020(36):1.
[2] 高惠敏,顏春榮,徐春祥,等.食品微生物檢驗中流式細胞術(shù)的研究進展[J].生物災(zāi)害科學(xué), 2023, 46(4): 549-556.
[3] Tian X X, Nanding K, Dai X Y, et al. Pattern recognition receptor mediated innate immune response requires a Rif-dependent pathway[J]. Journal of Autoimmunity, 134 (2023) 102975.  影響因子：14.511

微生物培養(yǎng)基原料：

流式檢測常用染料：

流式檢測常用串聯(lián)染料：

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