細胞氧化應激狀態(tài)評價實驗指南

一、什么是氧化應激狀態(tài)？

機體代謝過程中活性氧不斷地通過非酶促反應和酶促反應產(chǎn)生，每日約有1%-3%的攝入氧轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子(superoxide anion, O₂ˉ•)及其活性衍生物，但在抗氧化酶以及外源性和內(nèi)源性抗氧化劑的協(xié)同作用下被不斷清除，在生理情況下，ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡，活性氧可維持于有利無害的極低水平。由于內(nèi)源性和（或）外源性刺激使機體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量活性氧自由基，或機體抗氧化物質(zhì)不足，氧化劑/抗氧化劑間平衡失常，則使機體處于氧化應激狀態(tài)。當細胞處于氧化應激狀態(tài)時，可氧化損傷生物分子，并進一步引起細胞死亡和組織損傷，與很多病理過程相關(guān)^[1]。

二、氧化應激狀態(tài)評價方法

自由基的量可利用電子自旋共振法、化學發(fā)光法、化學捕獲法等進行測量。由于自由基的反應活性較強而壽命短暫，并且其濃度非常低，要對其直接進行測量非常不方便。自由基主要氧化損傷DNA、脂質(zhì)以及蛋白等生物分子，檢測組織和生物體液中的氧化應激代謝產(chǎn)物對評價氧化應激狀態(tài)尤其重要。

生物體內(nèi)，除極微量的 ROS被機體利用外，幾乎所有的ROS都應當及時被清除。特定ROS的生成過多又會引起機體產(chǎn)生相應的抗氧化物質(zhì)消除多余ROS。生物體內(nèi)防御ROS所致?lián)p傷的體系主要為抗氧化酶、抗氧化劑以及分隔過渡金屬的蛋白，它們均可特異性地限制人體的氧化損傷。

1、DNA的氧化產(chǎn)物

引起DNA氧化損傷的ROS主要是•OH。•OH可攻擊脫氧核糖，使脫氧戊糖分解、磷酸二酯鍵斷裂，引起 DNA出現(xiàn)單鏈或雙鏈斷裂。此外，•OH加到DNA堿基的π鍵上，產(chǎn)生特異性的嘌呤和嘧啶堿基修飾物，受損的 DNA可由核酸內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)葡糖基酶修復，并釋放出脫氧核苷酸和游離堿基，例如鳥嘌呤(guanine, G)被氧化而生成8-oxo-G，在修復酶的作用下以8-OHdG形式被切除，從尿排出。尿中8-OHdG是“全身"DNA受氧化損傷后經(jīng)切除修復而排出的量，可反映對氧化損傷的修復程度，因而8-OHdG被認為是內(nèi)源性氧自由基引起DNA氧化損傷的一種標志。此外還有利用彗星法DNA損傷分析試劑盒(abs60590-75T)檢測白細胞中氧化損傷引起DNA的斷裂來評價患者的氧化應激狀態(tài)。

2、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物

生物膜脂質(zhì)的磷脂中富含多不飽和脂肪酸(poly-unsaturated fatty acid, PUFA)在O₂存在條件下，極易被自由基及其活性衍生物攻擊，引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈式反應。同時在脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的LO•、LOO•、等也可產(chǎn)生鏈引發(fā)和鏈擴增反應。LOO•還可通過分子內(nèi)雙鍵加成，形成環(huán)過氧化物和環(huán)內(nèi)過氧化物自由基，最后斷裂為各種代謝產(chǎn)物。如過氧化脂質(zhì)經(jīng)脂氧基的β斷裂可產(chǎn)生許多醛類，如丙二醛和4-羥烴烯。測定生物樣品中的丙二醛(abs580011-96T)和4-羥壬烯均可反映脂質(zhì)過氧化，有文獻報道4-羥壬烯比丙二醛更能反映阿爾茨海默病患者的氧化應激狀態(tài)^[2]。

3、抗氧化酶

在抗氧化防護體系中，主要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, Cat)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)，可協(xié)助清除自由基，減輕和消除氧化損傷。在血漿、全血紅細胞或血小板以及組織中有一種不含硒的GSH-Px，又稱谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathioneS-transferase, GST)，可催化ROOH轉(zhuǎn)變?yōu)镽OH，協(xié)助GSH-Px清除體內(nèi)的ROOH。此外，谷甘肽還原酶(glutathione reductase, GSH-Re)可借助NADPH 提供電子促進氧化型谷胱甘肽(oxidizedghutathione, CSSG)再生為還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)，因而在機體抗氧化作用中也有重要作用。

各種抗氧化酶從不同角度協(xié)助清除體內(nèi)的ROS，在抗氧化過程中起著不同的作用，因而常測定血液中SOD(abs580010-96T)、Cat(abs580060-96T)、CSH-Px(abs580136-96T)以及GST(abs580046-96T)的量及活性來反映機體抗氧化活性，其中以SOD以及GSH-Px很受重視。

4、非酶抗氧化劑

非酶抗氧化劑非酶抗氧化劑主要是可清除自由基的低分子量物質(zhì)，包括谷胱甘肽、抗氧化維生素(VitE, VitC)、泛醌還原物、金屬硫蛋白及硫氧還蛋白等。

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種3肽化合物(Glu-Cys-Gly)，是需氧生物中主要的非蛋白硫醇，細胞內(nèi)其濃度在mM水平。GSH是一種抗氧化劑，而且GSH是多種酶如CSH-Px的輔酶，涉及多種生物學過程，參與清除•OH、HOC1、ONOO-、LO•、LOO•、O2ˉ•和H₂O₂等ROS，防護氧化應激對機體產(chǎn)生的損傷。 GSH(abs580006-96T)的量可在一定程度上反映機體的抗氧化能力。泛醌即CoQ₁₀(abs580226-96T)，是氧化磷酸化過程中線粒體呼吸鏈中必須的輔因子，其還原形式稱為泛醇(CoQ₁₀H₂)，可與VitE(abs580153-96T)協(xié)同中止脂質(zhì)過氧化鏈式反應，抑制脂質(zhì)過氧化的啟動和傳播，還可防止血漿中脂蛋白以及生物膜中脂質(zhì)過氧化。

5、總抗氧化能力

單獨測定某一種或某些抗氧化成分的含量往往不能全面反映組織的抗氧化能力，且有時操作上較為困難和繁瑣，因而可采用體液中的TAC(total antioxidant capacity)來評價機體總體上的抗氧化活性，這比測量已知的每一種抗氧化劑顯得更為有效。血漿的TAC值(abs580109-96T)可反映體液中已知和未知的抗氧化劑的多少，被認為是反映氧化應激的一個較好的指標。然而，對此種測試結(jié)果進行解釋時應當謹慎，因為在疾病中膽紅素或尿酸鹽的增加可掩蓋其它抗氧化劑的缺失。如對于腎功能衰竭患者，由于尿酸亦有抗氧化作用，因而不能用TAC反映腎功能衰竭患者真正的抗氧化能力^[3]。

很多疾病均與氧化應激相關(guān)，但還不十分清楚氧化應激是疾病的原因還是疾病過程中的一種結(jié)果。目前評價氧化應激狀態(tài)還缺乏一套可行的方法來反映不同的氧化應激狀態(tài)與疾病過程的相關(guān)性。在疾病研究中最好同時運用多種檢測手段，綜合所得的相關(guān)信息以對氧化應激狀態(tài)獲得一個更清楚的認識。

三、氧化應激狀態(tài)檢測在疾病研究中的應用

2024年4月1日，武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科萬軍教授團隊在Biochemical Pharmacology雜志上發(fā)表了題為“IL-23p19 deficiency reduces M1 macrophage polarization and improves stress-induced cardiac remodeling by alleviating macrophage ferroptosis in mice"的研究論文，該研究探討了IL-23p19是否調(diào)節(jié)心臟重塑過程并探討其可能的機制。

研究人員采用橫主動脈縮窄術(shù)構(gòu)建小鼠心臟重構(gòu)模型，并以假手術(shù)作為對照。結(jié)果顯示，手術(shù)后心臟中IL-23p19表達增加，可能主要由心臟巨噬細胞產(chǎn)生。 IL-23p19的敲除減弱了M1巨噬細胞的極化，減少了鐵死亡，改善了TAC小鼠的心臟重塑過程并減輕了心臟功能障礙。細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，當添加去氧腎上腺素(PE, abs816245)時，巨噬細胞是鐵死亡的主要原因，而鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1,abs813072)阻斷鐵死亡可顯著抑制M1型巨噬細胞極化。 Fer-1治療還改善了接受TAC手術(shù)的IL-23p19小鼠的心臟重塑并減輕了心臟功能障礙。最后，給予從WT小鼠分離的巨噬細胞的TAC IL-23p19小鼠表現(xiàn)出M1巨噬細胞比例增加和心臟重塑加劇，而當給予Fer-1時，這些影響被逆轉(zhuǎn)。 IL-23p19的敲除可能會減弱M1巨噬細胞的極化，從而通過減少巨噬細胞鐵死亡來改善心臟重塑過程，IL-23p19可能是預防和治療心臟重塑的潛在靶點。

圖1 用GSH檢測試劑盒(abs580006-96T)、MDA檢測試劑盒(abs580011-96T)測定大鼠血清中GSH和MDA的含量，結(jié)合SOD、LPO、ROS、組織鐵含量等水平評估細胞氧化應激程度^[4]。

接下來，小愛就以脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛 (MDA)檢測試劑盒為例，給大家詳細介紹試劑盒使用方法。

丙二醛檢測試劑盒使用方法介紹

一、試劑盒組分

二、操作步驟

1、材料和試劑準備

自備材料：酶標儀（可在532nm處讀取吸光值）、蒸餾水、移液器與槍頭、研缽、離心機、計時器、濕冰等。

Dye Reagent A：使用前加入5mL蒸餾水，放入70℃的水浴中，充分溶解后使用；

Dye Reagent Working Solution：當Dye Reagent A冷卻時，加入5mL染料試劑B，混合；

Standard：用乙醇連續(xù)2倍梯度稀釋。

2、樣本處理

1）細胞/細菌樣本：將細胞/細菌(5×10⁶)收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次）后于4℃ 8000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測。

2）組織樣本：稱取0.1g組織，加入1mL Assay buffer在濕冰上勻漿，4℃ 8000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測。

3）血清/血漿樣本：直接檢測。

3、上樣及檢測

按照如下表格順序從上到下依次加樣（注：不能混合在一起加樣）：

注：1）對于標準品，可進行2倍連續(xù)稀釋，制成標準曲線；

       2）對于未知的樣品，我們建議挑選幾個樣品進行預實驗，以確定樣品濃度和稀釋倍數(shù)。

4、標準曲線

標準曲線僅用于參考，每次實驗都必須做一條新的標準曲線。

檢測范圍：0.01mmol/L-1mmol/L

常見問題解答

Q1：試劑盒中的96-Well Microplate只有一個，不夠?qū)嶒炇褂迷趺崔k？

A1：該試劑盒中的96孔板是免費送的，后續(xù)實驗可以用常規(guī)的96孔酶標板代替。

Q2：試劑盒操作說明書中既有標準曲線法又有公式法，我應該選擇哪種計算方式？

A2：兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法，建議按照標曲計算，會更加準確。需要注意的是，使用標準曲線法，每次實驗必須重新繪制標準曲線。

Q3：試劑盒一次用不完，最長能保存多久？

A3：試劑盒中染料(Dye)溶解后易氧化變質(zhì)，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，不建議儲存。長期儲存可能影響顯色讀數(shù)進而影響檢測；如果樣本需要分批檢測，建議分批收樣儲存，待樣本收齊后統(tǒng)一檢測。此外，如因儲存時間過久或其他人為原因?qū)е陆M分不夠使用，可與我司聯(lián)系單獨購買試劑盒組分。

[1] 王秋林,王浩毅,王樹人.氧化應激狀態(tài)的評價[J].中國病理生理雜志, 2005, 21(10):2069-2074.

[2] McGrath IT,MeGleenon BM,Brennan S,et al. Increasedoxidative stress in Alzheimer's disease as assessed with 4-hydroxynonenal but not malondialdehyde[J].Quarterly Journa)of Medicine,2001,94(9):485-490.

[3] Bergesio F, Monzani G, Ciuti R, et al. Total antioxidant ca-pacity(TAC):is it an effective method to evaluate the oxida-tive stress in uraemia? [J]. J Biolumin Chemilumin, 1998,13(5):315-319.

[4] Lu X, Ji Q, Pan H, et al. IL-23p19 deficiency reduces M1 macrophage polarization and improves stress-induced cardiac remodeling by alleviating macrophage ferroptosis in mice. Biochem Pharmacol. 2024,222:116072. doi:10.1016/j.bcp.2024.116072.

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