外泌體研究解決方案

背景介紹

外泌體(exosomes)是一類由細胞分泌到胞外的囊泡，最早由Pan和Johnstone在綿羊網織紅細胞中發現并命名。隨著研究的深入，人們發現包括血細胞、免疫細胞、癌細胞、干細胞等在內的幾乎所有細胞都可以產生外泌體，所產生的外泌體不僅存在于細胞培養液中，也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔積液等體液中。外泌體可攜帶供體細胞中的一些物質，被認為是細胞間通訊和物質交換的重要載體，可通過直接或間接的形式調控細胞的功能和生物學行為。研究表明，外泌體參與腫瘤疾病的發展進程，可作為腫瘤的無創液體活檢中重要的標志物。外泌體的應用主要在疾病治療、生物標志物、藥物遞送等三大領域。

一、外泌體的提取與純化

如何高效、高純度地富集外泌體是實現其組學分析和功能研究的關鍵。然而外泌體體積小，密度低，加之在粒徑與組成方面存在異質性，即使同種細胞產生的外泌體也有可能形態各異，給外泌體的提取帶來巨大困難。如今已發展了多種基于外泌體尺寸、密度及免疫表型的提取方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、尺寸排阻色譜、免疫親和法等^[1]。

圖1 常用的外泌體分離方法

1、超速離心法：首先在300、2000和10000g離心力作用下去除樣本中的細胞、細胞碎片和大囊泡，隨后在110000g條件下收集外泌體，最后用磷酸鹽緩沖液(PBS, abs962)清洗沉淀以去除可溶的干擾蛋白質（圖1a）；

2、密度梯度離心法：屬于一種更為嚴格的超速離心法，能夠根據樣品密度進一步純化囊泡，克服蛋白質共沉淀造成的污染。常用的分離介質包括碘克沙醇(abs44121314)和蔗糖(abs47050864)。以蔗糖為例，實際操作時，需要預先制備不同濃度梯度的蔗糖/D₂O(abs47051532)溶液，隨后加入待分離物質。在超速離心力的作用下，外泌體將在等密度區域(1.13~1.19g/mL) 駐留，收集該組分即可得純化的外泌體（圖1b）；

3、尺寸排阻色譜法：以不同粒徑的聚合物凝膠填料作為分離介質，基于尺寸特征實現外泌體的分離（圖1c）。色譜柱采用穩定、多孔的凝膠顆粒填充，將含有外泌體的溶液加入到色譜柱中時，較小的顆粒將被捕獲在孔中，而較大的分子則不會進入孔中并被先洗脫。因此，不同階段的洗脫部分將包含不同大小的分子，首先是較大的外泌體顆粒，其次是較小的蛋白質和脂質顆粒(abs9777)；

4、超濾法：其原理與傳統的膜分離法相同。該方法通常選用相對分子截留量為100kDa 的超濾管，能夠在提取外泌體的同時濃縮樣本量，尤其適用于細胞培養液、尿液等大體積樣本（圖1d）；

5、親和法：親和提取法是目前特異性很好的一種外泌體提取方法，也是wei一一種能夠識別特定細胞來源的外泌體的方法。外泌體的親和提取主要通過抗體與外泌體膜蛋白質之間的特異性相互作用實現（圖1e）。所使用的抗體為單抗或多抗，目標蛋白質可以是外泌體表面普遍具有的CD63(abs159125)、CD9(abs131217)、CD81(abs159270)等跨膜蛋白質、膜聯蛋白質和上皮細胞黏附分子(EpCAM)等，也可以是癌細胞外泌體表面du有的標志性蛋白質；

6、基于聚合物的共沉淀法：聚合物沉淀法是商業化外泌體提取試劑盒通常采用的策略，其中聚乙二醇(abs42155612)是目前zui常用的沉淀試劑。一般認為聚合物沉淀法的原理是聚合物通過“劫持"水分子，降低外泌體溶解度，進而在低速離心條件下發生沉降（圖1f）。

二、外泌體的表征手段

目前可以通過電鏡、動態光散射、納米顆粒跟蹤分析儀、蛋白質免疫印跡、酶聯免疫吸附法、流式細胞儀等對外泌體進行表征。

通過電鏡可獲得外泌體的形態信息，不同類型的顯微鏡由于操作環境不同，得到的外泌體形態存在差異。例如，在掃描電鏡、透射電鏡和原子力顯微鏡中，外泌體呈現囊泡的茶托形（圖2a），可能由于樣品在固定或染色過程中極度脫水，導致外泌體塌陷所致。與之相反，在冷凍電鏡中外泌體呈現圓形，由于不會脫水變性，所得的外泌體形態可能更加接近囊泡的真實狀態（圖2b）。另外，由于透射電鏡和原子力顯微鏡具有較高分辨率，也能夠提供外泌體磷脂雙分子層厚度、粒徑分布等信息（圖2c）。

圖2a 掃描電鏡下外泌體呈現囊泡的茶托形^[2]。

圖2b 冷凍電鏡下外泌體呈現圓形，形態可能更加接近囊泡的真實狀態^[3]。

圖2c 透射/原子力電鏡下可觀察到外泌體磷脂雙分子層^[4]。

圖2  用不同類型顯微鏡觀察的外泌體形態

雖然目前幾種常用的表征方法尚有不足，但是多種方法結合能夠提高對外泌體的表征精度。隨著各項技術的發展，未來有望實現外泌體的準確、快速、可靠分析。

三、外泌體的示蹤技術

對分離的外泌體進行體外標記或體內活體示蹤，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。目前對于外泌體的標記方法有很多種，如熒光標記、生物素標記、量子點標記、免疫標記、同位素標記、基因標記等。其中，熒光標記由于操作簡單方便，是科研人員zui常用的外泌體標記方法。外泌體標記熒光染料包括DiR(abs45153692)、DiI(abs42002237)、DiO(abs45153674)、DiD(abs47048165)等，其中DiR的近紅外熒光可以穿透細胞和組織，也常用于小動物體內示蹤。此外，標記細胞膜的PKH26(abs9819)和PKH67(abs9820)試劑盒也被用于外泌體的標記。

下面小愛就以文獻為例給大家詳細介紹DiR標記外泌體并用于體內示蹤的具體步驟^[5]。

1、準備好分離純化的外泌體；

2、用2μM DiR(abs45153692)在37℃下標記外泌體1h，然后用SuperEV 0.5純化柱純化。

3、將不同量的外泌體腹腔注射到小鼠體內。注射24h后，將小鼠麻醉，并使用NIR-II Imaging System H成像系統成像。

為了進一步分析外泌體在組織中的位置，對組織進行篩選、固定和切片，并使用尼康TI2-E+A1 R共聚焦顯微鏡檢測DiR信號(Ex/Em = 748/780nm)。

圖3 外泌體(EVs)治療24h后，大多數熒光信號仍留在正常小鼠的注射部位(a)。相反，在EVs處理的AP小鼠中，熒光信號擴散到腹部，胰腺顯示出比用F4/80- EVs治療的AP小鼠更強的熒光信號。

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[1] 高方園,焦豐龍,張養軍,等.外泌體分離技術及其臨床應用研究進展[J].色譜, 2019, 37(10):13.

[2] Shao H, Im H, Castro C M, et al. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles[J]. Chemical Reviews, 2018, 118(4):1917.

[3] Li P, Kaslan M, Lee S H, et al. Progress in Exosome Isolation Techniques[J]. Theranostics, 2017,7(3):789.

[4] Pisitkun T, Shen R F, Knepper M A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(36): 13368.

[5] Gao Y, Mi N, Wu W, et al. Transfer of inflammatory mitochondria via extracellular vesicles from M1 macrophages induces ferroptosis of pancreatic beta cells in acute pancreatitis[J]. J Extracell Vesicles, 2024;13(2):e12410.

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