從零開始-細胞培養入門指南

細胞是生命的基本單位，是生物學研究中非常有用的工具。細胞培養的過程就是人工模擬細胞體內生長環境，置于無菌、適宜溫度及酸堿度的環境中，保證充足的營養使其不斷生長繁殖，并維持其結構和功能。作為基礎又常規的實驗技能，自然頗受關注。后續會創建《常見細胞培養攻略》系列，會為大家介紹一些常見細胞的培養方案，包括但不限于T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、干細胞培養等。今天主要是細胞培養入門指南的相關內容，其他的內容大家可以持續關注追更。

1. 細胞類型

1) 原代細胞(primary cell)：是指從機體的組織經蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養的細胞，稱為原代細胞。一般認為，培養的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。

2) 細胞系(cell line)：原代細胞經初次傳代成功后即為細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系所組成。其中能夠連續傳代的細胞叫做連續細胞系或無限細胞系，不能連續培養的稱為有限細胞系。

3) 細胞株(cell strain)：是通過選擇法或克隆形成法從原代培養細胞中獲得具有特殊性質或標志物的細胞稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。

圖1 動物細胞培養的步驟(General Procedure for Cell Culture)

2. 培養體系

1) 培養體系的選擇：主要分為含血清的經典培養體系和無血清培養體系。簡單、細胞種類、小規模選擇含血清培養體系；長周期、強掌控、追求細胞質量可選擇無血清培養體系。

表1 含血清和無血清培養體系的區別圖（圖片源于優寧維）

2) 血清的選擇：分為胎牛血清、新生牛血清、小牛血清；其中胎牛血清的普適性較好。血清主要為細胞提供基本的營養；血清中的微量元素可參與細胞的解毒代謝；血清中的抗蛋白酶成分也可以起到中和保護細胞的作用。小伙伴們想要了解更多血清信息，可以查看《細胞培養常見問題之血清篇》。當然，具體細胞使用何種血清可以參考相關文獻或者實驗組的經驗。

表2 不同血清的區別圖（圖片源于優寧維）

3) 基礎培養基的選擇：根據培養基的來源和組成成分，分為天然培養基（組織提取液）、合成培養基（經典液體培養基如1640、DMEM等）、無血清培養基（如Lonza的X-VIXO系列培養基）。目前合成培養基和無血清培養基使用居多。同樣，具體細胞使用何種培養基也可以參考相關文獻或者實驗組的經驗。

4) 抗生素：目前實驗室會在細胞培養過程中添加雙抗（青霉素-鏈霉素）或者三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）用來預防細胞污染，但是對于長期的細胞培養并不建議持續使用抗生素，以防細胞產生耐藥性。

5) 培養基中酚紅的選擇：作為PH指示劑，酚紅是培養基的“常客"。酚紅為雌激素類似物，在進行激素誘導或培養雌激素敏感的細胞時應慎用，另外酚紅可能對下游的流式檢測分析帶來一定的干擾。

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3. 細胞來源

1) 從有資質的公司直接進行購買：比如Absin可提供全面的原代細胞及優化后適配的培養基，試劑和方案；ATCC作為全球quan威的生物資源中心之一，提供原代細胞、細胞系、微生物、重組物質等。

2) 從生物體中提取制備：如血液樣本、實體組織樣本等。

3) 實驗室現有的凍存細胞復蘇獲得：細胞復蘇的步驟在基本操作里面，大家可以接著往下讀。

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4. 細胞培養相關信息收集及物質

所謂信息收集是指我們要在開始細胞培養前充分全面了解我們的細胞，大家可以參考文獻、ATCC的或者是實驗室的經驗，需要獲得的信息包括不限于以下幾個方面：

1) 細胞特性：細胞的形態、增殖速度、細胞周期、傳代頻率……

2) 生長方式：貼壁or懸浮

3) 培養體系：含血清or無血清

4) 溫度：多數人和哺乳動物細胞系是36-37℃；昆蟲細胞27℃

5) PH：多數哺乳動物細胞系是7.4，昆蟲細胞系6.2

6) CO2：多數適合5-7%CO2

5. 細胞培養基本原則

1) 無菌意識：使用無菌設備、試劑和耗材；使用個人防護裝備，避免污染；試劑如有需要可使用0.22μm的過濾器進行無菌過濾；每次操作只處理一株細胞株，以避免失誤混淆或細胞間污染，實驗進行前，超凈臺以紫外燈照射 30 分鐘滅菌，以 70 % 乙醇擦拭無菌操作臺面；實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以 70 % 乙醇 擦拭無菌操作臺面。

2) 試劑分裝：培養基、血清、胰酶等試劑要養成分裝保存的習慣，不同的細胞即使適配的培養基配方相同也要另外配制分裝并做好標記。

3) 及時保種：尤其是珍貴細胞，在細胞狀態良好的時候要及時凍存保種，以備不時之需。

6. 基本操作

1) 顯微鏡觀察：首先觀察細胞培養液的顏色（如果培養基中含有酚紅指示劑的話，當培養液顏色變為黃色就意味著營養物質耗盡），其次鏡下觀察細胞的生長狀態。如果細胞的長勢良好，且匯合度未達到傳代的要求，可視培養液顏色決定時候換液；若細胞生長狀態不好，匯合度低，需要酌情優化培養條件，排除污染情況；若細胞過于密集，則需進行傳代操作。

細胞匯合是指細胞在培養皿中附著生長的過程。匯合度是指細胞覆蓋培養皿的百分比，不同類型的細胞需要達到不同匯合度后才能進行傳代。

圖2 顯微鏡觀察細胞流程（圖片源于優寧維）

2) 細胞復蘇

圖3 PBMC細胞復蘇流程圖
（PBMC Thawing Protocol: How to Optimize Cell Recovery）

a) 37℃水浴加熱需要使用的培養基；

b) 從液氮中取出要復蘇的細胞，盡量減少其暴露在室溫（15-25℃）的時間；

c) 在37℃水浴快速解凍細胞，將凍存管轉移到生物安全柜中，用70%乙醇或異丙醇擦拭凍存管外部；

d) 將細胞懸浮液轉移到50mL離心管中，加入1mL培養基潤洗凍存管，培養基同樣收集到50mL離心管中；

e) 向50mL離心管中補加15-20mL培養基，室溫300xg離心10分鐘；

f) 小心棄掉離心后的上清液，使用適量wan全培養基重懸細胞，分裝到合適的培養皿/瓶中，顯微鏡下觀察細胞密度和狀態，放入CO2培養箱中培養。

3) 細胞傳代

圖4 細胞傳代流程圖
（Cell Plating, Media Change, and Culture Maintenance Protocol）

a) 顯微鏡下觀察細胞狀態、匯合度以及是否污染，判斷是否進行傳代處理；

b) 以25cm2培養瓶、貼壁細胞為例，棄掉培養基，使用無菌PBS洗滌細胞以去除抑制胰蛋白酶功能的血清；

c) 加入2ml胰酶，覆蓋細胞層，放入37℃ CO2培培養箱中孵育2min，期間可拿出觀察細胞消化脫落情況（注意：不同細胞使用的胰酶濃度及消化時間不同）；

d) 棄掉胰酶，加入2ml wan全培養基吹散細胞；

e) 顯微鏡下計數，調整細胞密度分裝到培養瓶中，將細胞置于 37oC, 5% CO2 的培養箱中培養。

4) 細胞凍存

圖5 分步凍存法流程圖

a) 在細胞密度達到107 cells/mL時可進行凍存，采用分步冷凍法；

b) 懸浮細胞500 g室溫離心10 min收集細胞沉淀，貼壁細胞胰酶消化并終止后離心收集；

c) 棄上清，凍存液重懸細胞沉淀，1mL分裝并做好標記；

d) 將凍存管放置-20℃ 1h；-80℃過夜；轉移至液氮中進行長期保存。

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