WB疑難雜癥——膜蛋白

什么是膜蛋白？

膜蛋白是細(xì)胞膜的重要組成部分，負(fù)責(zé)許多關(guān)鍵的生物學(xué)功能如物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞間識(shí)別等，人類基因組中編碼的膜蛋白約占總蛋白質(zhì)組的25%左右。它們可以根據(jù)其與膜的結(jié)合方式和功能特點(diǎn)被分為不同的類別。以下是膜蛋白的一些主要類型和功能：

1、膜蛋白分類

外在膜蛋白：這些蛋白分布在細(xì)胞膜的內(nèi)外表面，約占膜蛋白的20%-30%，主要在內(nèi)表面。它們通過(guò)離子鍵、氫鍵與膜脂分子的極性頭部相結(jié)合，或通過(guò)與內(nèi)在蛋白的相互作用，間接與膜結(jié)合，大多是親水性蛋白，主要的類型有酶類、受體蛋白、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、免疫相關(guān)蛋白、細(xì)胞間連接蛋白等。

內(nèi)在膜蛋白：這些蛋白約占膜蛋白的70%～80%，是雙親媒性分子，可以不同程度地嵌入脂雙層分子中。有些貫穿整個(gè)脂雙層，兩端暴露于膜的內(nèi)外表面，這種類型的膜蛋白也稱為跨膜蛋白，包括跨膜離子通道蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、跨膜受體酪氨酸激酶(RTKs)等。

脂錨定膜蛋白：這類蛋白通過(guò)與之共價(jià)相連的脂分子插入膜的脂雙分子中，從而錨定在細(xì)胞質(zhì)膜上。

2、研究膜蛋白有什么意義？

疾病治療：膜蛋白在許多生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞識(shí)別等。許多疾病，如囊性纖維化、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病，都與膜蛋白的功能異常有關(guān)。研究膜蛋白有助于理解這些疾病的發(fā)病機(jī)制，并為開(kāi)發(fā)新的治療方法提供靶點(diǎn)。

藥物開(kāi)發(fā)：大約60%的藥物作用于膜蛋白，如G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。通過(guò)研究這些膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，科學(xué)家可以設(shè)計(jì)出更有效的藥物來(lái)調(diào)節(jié)它們的活性，從而治療相關(guān)疾病。

生物醫(yī)學(xué)研究：膜蛋白在細(xì)胞間的通訊、細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的響應(yīng)以及細(xì)胞的免疫功能中扮演關(guān)鍵角色。這些研究有助于我們理解細(xì)胞如何感知和適應(yīng)環(huán)境變化，以及如何在細(xì)胞層面上調(diào)控生物過(guò)程。

生物膜結(jié)構(gòu)的理解：細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)性質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生存至關(guān)重要。研究膜蛋白如何與膜脂質(zhì)相互作用，可以幫助我們更好地理解生物膜的物理性質(zhì)和生物物理學(xué)。

生物技術(shù)應(yīng)用：膜蛋白的研究可以促進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展，例如在生物傳感器、藥物篩選和納米技術(shù)等領(lǐng)域。了解膜蛋白的特性可以幫助設(shè)計(jì)出更有效的生物技術(shù)工具。

細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究：膜蛋白是細(xì)胞膜的主要組成部分，研究它們有助于我們理解細(xì)胞膜的生物合成、維持和修復(fù)等基本細(xì)胞過(guò)程。

農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)：在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中，膜蛋白的研究有助于改良作物和家畜的性狀，例如通過(guò)基因工程改變植物的膜蛋白來(lái)提高其對(duì)疾病的抵抗力或改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

環(huán)境科學(xué)：在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，膜蛋白的研究有助于理解微生物如何與環(huán)境相互作用，例如在生物修復(fù)和污染物的代謝過(guò)程中。

3、如何知道自己研究的蛋白是不是膜蛋白？

可以通過(guò)uniprot進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，方法很簡(jiǎn)單，只需要輸入蛋白名稱，選擇相應(yīng)的物種，進(jìn)入詳情頁(yè)面。

選擇亞細(xì)胞定位即可了解該蛋白在細(xì)胞中的分布情況。

當(dāng)然，也可以通過(guò)YLoc、Cell-PLoc等工具進(jìn)行相互驗(yàn)證。

4、膜蛋白WB難在哪？

膜蛋白有很多屬于大分子量蛋白，比起小分子量蛋白，提取和轉(zhuǎn)膜更加困難。

提取困難：膜蛋白與膜結(jié)合緊密，不易從膜上洗滌下來(lái)，特別是跨膜蛋白，具有：

1）結(jié)構(gòu)復(fù)雜：跨膜蛋白擁有多重跨膜結(jié)構(gòu)域，通過(guò)疏水作用緊密地嵌入到細(xì)胞膜中，這使得它們?cè)谒械娜芙舛确浅５停灰妆惶崛　?/span>

2）表達(dá)量低：膜蛋白在樣品中的表達(dá)量通常不高，如果不富集，在總蛋白中占比較低，用總蛋白檢測(cè)時(shí)，可能無(wú)法檢測(cè)到。

3）易形成多聚體：膜蛋白由于其跨膜區(qū)域的疏水性，加熱時(shí)疏水相互作用可能會(huì)增強(qiáng)，導(dǎo)致膜蛋白分子間相互聚集，形成聚合物。

4）分子量大：部分膜蛋白分子量較大，大分子量蛋白WB，電泳，轉(zhuǎn)膜等條件需要摸索，較為困難。

面對(duì)膜蛋白我們應(yīng)該如何處理？

1、了解自己研究蛋白的特性

可以通過(guò)uniprot、topcons、The Human Protein Atlas等工具，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，了解研究蛋白的在組織及各種細(xì)胞中的表達(dá)量、是否屬于跨膜蛋白等，表達(dá)量較高且不屬于跨膜蛋白的，蛋白相對(duì)好提取，可以用總蛋白提取方式，對(duì)于跨膜蛋白或者表達(dá)量相對(duì)較少，不好提取的蛋白，可以先進(jìn)行膜蛋白富集(abs9346-50T)。

abs9346-50T 細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒

2、蛋白變性

為了避免膜蛋白熱變性收到溫度影響產(chǎn)生多聚體，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議建議根據(jù)蛋白具體屬性在50-70℃左右進(jìn)行熱變性或者采用37℃。

3、電泳

分離膠的選擇

根據(jù)蛋白分子量大小選擇凝膠濃度，需要同時(shí)分離分子量跨度較大的多種蛋白，也可以選擇梯度膠，大分子蛋白最好使用 Tris-Acetate體系進(jìn)行電泳，absin的Tris-Acetate預(yù)制膠能夠有效分離40-500kDa的大蛋白分子，采用玻璃膠板，有效減少蛋白非特異性吸附，使蛋白條帶更為尖銳，清晰。電泳時(shí)，可采用120-150V的高電壓，在冰水浴中進(jìn)行，盡量使Marker拉開(kāi)足夠大的距離，通常需要4小時(shí)左右。

4、轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)印膜的選擇

濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜時(shí)間長(zhǎng)，300mA電流條件下，150-180KDa的蛋白需要3-3.5h，180-250KDa需要4-5h，大于250KDa需要5.5-6h，濕轉(zhuǎn)法通常效果比較好，比較推薦。半干轉(zhuǎn)，40V恒壓，轉(zhuǎn)膜60-90min，小于400KDa的蛋白一般都能轉(zhuǎn)到PVDF膜上。恒流法轉(zhuǎn)，電流大小設(shè)置為PVDF膜的面積，時(shí)間1小時(shí)左右，半干轉(zhuǎn)節(jié)約時(shí)間。

其他問(wèn)題可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)調(diào)整。

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