線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)

描述：

線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以 產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光 到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠 色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。JC-1單體的最大激發(fā)波長為515nm，最大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物的最大 激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光 的設(shè)置即可。本試劑盒提供了CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可 以檢測200個樣品。

使用方法：

1、JC-1染色工作液的配制
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推：對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mLJC-1染色工作液。取適量JC-1（200×），按照每50μLJC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。

2、陽性對照的設(shè)置：
把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照1∶1000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細胞，通常10μMCCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻資料決定。

3、對于懸浮細胞
取10～60萬細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育結(jié)束后，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。
再加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4、對于貼壁細胞
注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細胞一次，加入1mL細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。加入1mLJC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。
加入2mL細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體
把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。
0.9mL5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（timescan），激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進行熒光檢測。
用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6、熒光觀測和結(jié)果分析檢測
JC-1單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時的設(shè)置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項：

1、JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2、必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-1染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會很難充分溶解，會嚴重影響后續(xù)的檢測。
3、裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。
4、JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。
5、請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。
6、如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。
7、CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。
8、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品引用文獻：

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Jiankang Cao, Qiong Fang, Chenrui Han, Chongshan Zhong

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SNORC knockdown alleviates inflammation, autophagy defect and matrix degradation of chondrocytes in osteoarthritis development

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影響因子： 4.3

Water Extract of Rice False Smut Balls Activates Nrf2/HO-1 and Apoptosis Pathways, Causing Liver Injury

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Rice Science. 2023 Aug 23 .

影響因子： 4.8

The novel polyfluoroalkyl benzenesulfonate OBS exposure induces cell cycle arrest and senescence of rat pituitary cell GH3 via the p53/p21/RB pathway

Miao Zhang, Xiaowen Bi, Shuai Liu, Yu Liu, Qiyu Wang

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Heat stress inhibits the proliferation and differentiation of myoblasts and is associated with damage to mitochondria

Jiawei Lu, Huixia Li, Debing Yu, Peng Zhao, Yuan Liu

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Growth Hormone Promotes Oocyte Maturation In Vitro by Protecting Mitochondrial Function and Reducing Apoptosis

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Endothelial LRP1-ICD Accelerates Cognition-Associated Alpha-Synuclein Pathology and Neurodegeneration through PARP1 Activation in a Mouse Model of Parkinson’s Disease

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Curcumin exerts chondroprotective effects against osteoarthritis by promoting AMPK/PINK1/Parkin-mediated mitophagy

Zhuangzhuang Jin, Bohan Chang, Yingliang Wei, Yue Yang, He Zhang, Jiabao Liu, Longhuan Piao, Lunhao Bai

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Momordica. charantia-Derived Extracellular Vesicles-Like Nanovesicles Protect Cardiomyocytes Against Radiation Injury via Attenuating DNA Damage and Mitochondria Dysfunction

Wen-Wen Cui, Cong Ye, Kai-Xuan Wang, Xu Yang, Pei-Yan Zhu, Kan Hu, Ting Lan, Lin-Yan Huang, Wan Wang, Bing Gu, Chen Yan, Ping Ma, Su-Hua Qi, Lan Luo

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