WB試驗之如何選擇內(nèi)參抗體

檢測某一個基因的表達產(chǎn)物或者要比較表達產(chǎn)物量的相對變化，方法是western blot。而Western Blot試驗中比較這些的前提條件是等量的細(xì)胞上樣，這樣才有比較的基礎(chǔ)。而人為的操作會產(chǎn)生一定的誤差，這些誤差可以通過測定每個樣品中實際轉(zhuǎn)到膜上的內(nèi)參來校正。因此選擇一個合適的內(nèi)參抗體來校正上樣誤差是非常重要的。所以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中需要有良好的參照體系，后續(xù)的實驗結(jié)果分析才具有說服性。

在Western Bloting實驗中，可能內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control)，對于哺乳動物細(xì)胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細(xì)胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。

在Western Blotting 中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH、beta-actin和beta-tubulin等。對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內(nèi)參，同樣的，如果提取的樣本是細(xì)胞核蛋白，那么PCNA或者組蛋白H3都是被經(jīng)常使用的，而針對一些研究線粒體的客戶，那么Cox IV則被較多的文獻引用作為線粒體總蛋白的內(nèi)部參考。下面就常用的一些內(nèi)參抗體做一些介紹。

1.GAPDH抗體

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，由4個30-40kDa的亞基組成，分子量146kDa，檢測條帶大約在36kDa。GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達，被廣泛地用作Western blot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。

2. β-Tubulin抗體

Tubulin即微管蛋白，是細(xì)胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的zui主要的兩種Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kDa和50kDa，其實際檢測條帶均在55kDa左右。作為內(nèi)參，β-tubulin的蛋白水平通常不會發(fā)生改變，因此被廣泛用于Western Blotting時上樣量是否一致的參照，α-Tubulin和β-Tubulin構(gòu)成微管蛋白的結(jié)構(gòu)也常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)。

3. Beta-Actin內(nèi)參抗體

Actin即肌動蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作為內(nèi)參是得到了*的，這是針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達量非常豐富，其含量占所有細(xì)胞總蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情況下，如脂肪組織或細(xì)胞β-Actin抗體推薦—價的內(nèi)參抗體內(nèi)，β-Actin的表達量就很少。β-actin由375個氨基酸組成，分子量大小為42-43kDa左右。

那么如何選擇合適的內(nèi)參抗體呢？內(nèi)參抗體雖然選擇較多，但是也需要遵循一定的原則，并契合實際的應(yīng)用需要。推薦的內(nèi)參要與檢測的目的蛋白的分子量相差5KD以上，因此需要根據(jù)目的檢測蛋白的分子量來選擇合適的內(nèi)參，例如：GAPDH的檢測分子量大約在36kD，因此該內(nèi)參抗體不是很適合用于檢測30kD-40kD大小目標(biāo)蛋白的WB實驗中；β-Actin的檢測分子量大約在42kD，因此該內(nèi)參抗體不是很適合用于檢測38kD-48kD大小目標(biāo)蛋白的WB實驗中。另外，不同的組織來源的樣本在選擇內(nèi)參時還有一定的區(qū)別。比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達增高，不適合做內(nèi)參。另外，雖然β-Actin是zui合適的內(nèi)參抗體之一，但是在某些條件下，一些因素也會導(dǎo)致樣品間β-Actin含量的變化，例如在脂肪組織里，β-Actin的表達量非常低，就不適合作為內(nèi)參。

就一般的蛋白檢測來說，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻報道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。

以上幾條原則只是針對通常情況，但是需要注意的問題是——內(nèi)參的選擇需要考慮實際的試驗環(huán)境并查詢相應(yīng)文獻，在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達出現(xiàn)異常，應(yīng)綜合考慮這方面因素。

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