細(xì)胞培養(yǎng)的步驟有哪些

　　細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)不可少的過(guò)程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。

　　細(xì)胞培養(yǎng)的步驟

　　1、復(fù) 蘇

　　細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化

　　必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

　　實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。

　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75%酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面，保證無(wú)菌。

　　在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

　　取出凍存管

　　根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對(duì)應(yīng)編號(hào)。

　　從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

　　迅速解凍

　　迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

　　約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

　　平衡離心

　　用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3分鐘。

　　制備細(xì)胞懸液

　　吸棄上清液。

　　向離心管內(nèi)加入適量培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

　　用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　細(xì)胞計(jì)數(shù)

　　細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

　　培養(yǎng)細(xì)胞

　　將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h(或者24-48h)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞情況而定。

　　記錄復(fù)蘇日期

　　2、傳 代

　　01、傳代密度過(guò)高

　　一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過(guò)高(>90%)才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤(pán)傳代，細(xì)胞也無(wú)法回到原本的特性了。(如：?jiǎn)螌蛹?xì)胞，沒(méi)長(zhǎng)滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象)。

　　解決方案

　　盡量避免融合度過(guò)高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤(pán)。

　　細(xì)胞融合度：在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例。

　　02、傳代密度過(guò)低

　　哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開(kāi)始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無(wú)法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號(hào)傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長(zhǎng)因子濃度會(huì)不足以產(chǎn)生利于生長(zhǎng)的微環(huán)境，以上皆會(huì)造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。

　　解決方案

　　細(xì)胞傳代時(shí)，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保鋪盤(pán)的密度。

　　3、凍 存

　　細(xì)胞凍存的基本原理：慢凍

　　手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃(30分鐘)、-20℃(1小時(shí))、-80℃(過(guò)夜)后移至液氮中保存。

　　程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器(填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱)，使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃(過(guò)夜)，然后移至液氮中保存。

　　由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動(dòng)降溫。

　　部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過(guò)程中雖然會(huì)保護(hù)細(xì)胞，但它們也會(huì)引起細(xì)胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會(huì)含有血清，血清是用來(lái)降低細(xì)胞毒性的，但血清也不是完整的。