基因的編輯調控技術—轉染，您了解多少？

轉染——是將外源基因如DNA、RNA導入真核細胞的技術。是真核細胞在一定條件下主動或被動導入外源基因而獲得新的表型的過程。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、基因表達調控、突變分析和蛋白質生產等領域中，轉染技術的應用越來越廣泛。

圖1 轉染

根據外源性基因在真核細胞中表達時間的長短我們可將轉染技術可分為瞬時轉染和穩定轉染兩種。在瞬時轉染的細胞中，外源基因得以表達但它們并不會整合到細胞的基因組中，也就不會被復制，適用的核酸類型主要包括質粒DNA、siRNA、miRNA和mRNA。細胞瞬時轉染的外源基因表達時間有限，通常僅持續幾天，直到外源基因在細胞分裂過程中因各種因素丟失為止。穩定轉染是建立在瞬時轉染的基礎上的，先對細胞進行轉染，再對得到的細胞進行篩選，在少數轉染細胞中，外源基因能夠整合到細胞的基因組中。適用的核酸類型只有質粒DNA，且外源基因成為細胞基因組的一部分從而得以復制，這就是穩定轉染細胞的標志。穩定轉染細胞的子代細胞也同樣表達外源基因，由此形成穩定轉染的細胞系。

圖2 瞬時轉染和穩定轉染的區別

1．化學介導法

主要是使用載體分子去中和或者使帶負電的核酸帶正電荷，讓核酸更容易進入細胞內。主要包括DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法、陽離子脂質體法、陽離子聚合物法等。

2．物理介導法

物理介導法是將核酸直接遞送到細胞質或細胞核中。主要包括電轉染、顯微注射法、基因槍法。

3．生物介導法

又稱之為病毒介導法，是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。病毒介導法轉染效率很高，尤其是針對難轉染的活體細胞、原代細胞。主要包括慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒等病毒介導法。

圖6 細胞轉染的途徑

圖7 細胞轉染流程圖

以質粒DNA為例介紹細胞轉染的流程(24孔板、貼壁細胞、核酸轉染試劑盒(貨號：abs60259))：

1.1儀器設備

CO₂培養箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋、醫用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、細胞計數儀等。

1.2試劑耗材
DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖溶液(PBS)、胰酶、核酸轉染試劑盒(abs60259)、24孔板、1.5ml無菌離心管若干等。

Step1 細胞接種:

1．轉染前一天對細胞進行轉接，每孔接種1.5-2.0×10⁵個細胞，使轉染時細胞密度為90%左右，且生長良好(非常重要)；

2．最好在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養不足導致細胞死亡。

Step2 試劑A/DNA轉染復合物制備(該步完成后應立即進行轉染):

1．在1.5 ml無菌離心管A中加入50µl無血清培養基，再加入適量的轉染試劑A，見下表8。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2．在1.5 ml無菌離心管B中加入50µl無血清培養基，并加入適量的試劑B，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見下表8。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3．將DNA-培養基混合物滴加至試劑A-培養基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后，立即轉染。

注意： 1. 試劑A-培養基混合物和DNA-培養基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。

  2. 離心管最好使用聚丙烯離心管。

Step3 轉染:

1．將Step2制備的轉染復合物滴加至培養基中，邊加邊輕輕晃動培養板以使復合物均勻分布。加完后，立即將培養板轉入培養箱繼續培養。

2．培養12小時后即可觀察，最佳觀察或收獲時間為24~48小時。

3．試劑A在培養基中仍有較高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清或低血清培養基。

表8 質粒轉染不同培養體系推薦初始轉染條件

細胞密度對轉染效率有一定的影響。不同的轉染試劑，要求轉染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。轉染時過高或者過低的細胞密度會導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑，最好能夠進行優化實驗并為以后的實驗建立一個穩定方法，包括適當的接種量和培養時間等。陽離子脂質體試劑具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數，有的要求細胞達到90%匯合度；而研究細胞周期等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉染的試劑。一般轉染時貼壁細胞密度大致為50%-90%，但這個需要參考所選轉染試劑的說明書。

這點非常關鍵，很多時候傳代次數太少或者太多都將導致細胞對轉染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉染效率以及轉染穩定性、降低細胞毒性，應盡量使用適度傳代、生長狀態良好的細胞系。轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數生長期的細胞，細胞生長旺盛,最容易轉染。

不同細胞種類的細胞在做轉染時轉染效率通常不同，因此所需要的轉染體系是不同的，不能一種轉染體系用在所有類型細胞的轉染實驗。實驗前應根據實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。每種轉染試劑都有不同的轉染方法，但大都大同小異，同時目前產品都會提供一些已經成功轉染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇實驗設計的轉染試劑。另外，在大規模使用前，仍需進行轉染試劑和核酸比例的實踐摸索。

用于轉染的核酸類型一般有質粒DNA、mRNA 、sirNA和miRNA，針對不同的核酸一般采用不同的轉染試劑和轉染方法。另外在制備高純度DNA時，還需要對DNA進行內毒素的去除，內毒素的存在會造成細胞毒性，嚴重影響轉染效率。同時DNA質量對轉染的效果影響也非常大，一般轉染技術是基于電荷吸引原理，如果DNA不純，帶有污染物都會顯著影響轉染復合物的的形成。

圖9 細胞轉染圖

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