多色類(lèi)器官寶典：肺癌類(lèi)器官的培養(yǎng)與多色鑒定

一、肺癌類(lèi)器官構(gòu)建——Organotial人肺癌類(lèi)器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9443）

（1）取材后的組織須放在預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液的取樣瓶中，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和細(xì)胞分離，拍照并登記信息。

（2）準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的原代培養(yǎng)緩沖液備用。

（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養(yǎng)皿中，利用原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次后，去除雜質(zhì)，利用眼科剪或手術(shù)刀將組織剪切成體積約為1-3mm³的組織塊。

（4）組織用人肺癌原代組織消化液消化，37℃震蕩消化10-20min（消化過(guò)程中隨時(shí)觀察消化情況）。

（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個(gè)細(xì)胞或70um以下的細(xì)胞簇后，加入三倍體積原代培養(yǎng)緩沖液終止消化。

（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)（abs7009）進(jìn)行過(guò)濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加原代培養(yǎng)緩沖液重新重懸離心。

（7）基質(zhì)膠計(jì)算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸鋪板。

（8）24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。

（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加人肺癌類(lèi)器官培養(yǎng)基（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。

二、多重熒光免疫組化鑒定——六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（abs50014）

（1）樣本制備：類(lèi)器官樣本制備，參考類(lèi)器官實(shí)操大本營(yíng)之——固定包埋
（2）烤片：60℃烤片30min。
（3）脫蠟、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min)。
（4）抗原修復(fù)：取200ml抗原修復(fù)液，加入染色盒中，將組織切片置于染色盒內(nèi)耐高溫塑料切片架上，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓，然后繼續(xù)加熱5min，關(guān)閉電源，10min后取出染色盒，室溫冷卻30min，畫(huà)上阻水圈，置入PBST浸洗3次，每次3min。
（5）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：每切片加100μL3% H₂O₂，室溫下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。
（6）封閉：除去PBST液，每張切片加100μL 5% 山羊血清封閉液，室溫孵育30min，除去封閉液。
（7）一抗孵育：每張切片加100μL一抗工作液，室溫保濕孵育1h，PBST浸洗3min×3次。
（8）二抗孵育：除去PBST，每張切片加100μL二抗，室溫保濕孵育15min，PBST浸洗3次，每次3min。
（9）染料孵育：除去PBST，每張切片加100μL現(xiàn)配的1*染料工作液（使用信號(hào)放大液按1:100稀釋?zhuān)跤?0min后，置入PBST內(nèi)洗滌，室溫浸片洗滌3次，每次3min。
（10）抗體洗脫：抗體洗脫液（abs994）37℃ 預(yù)熱，滴加少量抗體洗脫液覆蓋樣本，室溫放置3~5min；棄去洗脫液，再次滴加足量的洗脫液覆蓋樣本，37°C 孵育20min；PBST浸洗3次，每次3min。
（11）重復(fù)步驟（6）-（10），直至所有目標(biāo)抗體染色完成。
（12）核染：滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒(méi)樣本區(qū)域，室溫孵育10min后，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min。
（13）封片：滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡。
（14）掃描成像，數(shù)據(jù)分析。

Absin肺癌類(lèi)器官多色風(fēng)采展

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