Absin一種類器官藥敏活性檢測方法

更新時間：2023-07-27 點擊次數：876

類器官在藥敏藥篩這塊的活力檢測方法采用ATP生物發光技術的方法相對其它方法更簡便，更準確。小愛帶您了解一下檢測方法吧。

1、ATP生物發光技術原理

在類器官細胞培養物中加入相應試劑使類器官裂解，釋放ATP，熒光素酶催化底物熒光素的轉化，高效利用ATP的能量，發射光子形成光信號。發光強度與ATP在一定范圍內成正比，而ATP又與活細胞數目又呈正比，因此可以對類器官活細胞數目進行定量檢測。

2、類器官ATP生物發光方法

（1）類器官的準備

使用適合進行發光檢測的24孔板，每孔接種類器官與基質膠混合物25ul平鋪到孔底部，同時設置不含類器官的基質膠與培養液孔作為陰性對照，按照類器官培養的常規方法培養類器官。如有需要，可加入藥物處理類器官。此外，如有必要也可以設置類器官的濃度梯度，以便后續確定試劑盒的使用效果。

（2）試劑準備

a. 融化：將ATP活性檢測試劑盒置于2~8℃或室溫條件下融化；
b. 使用前輕柔顛倒幾次使溶液混合均勻。

（3）檢測步驟

a. 于培養箱中取出待測類器官培養板，室溫放置30min，以使培養板溫度平衡至室溫；
b. 加入與待測類器官培養物等體積并平衡至室溫的緩沖液(abs9730)。例如，使用24孔培養板時，先去除類器官培養基，用類器官緩沖液置換靜置清洗3次，然后吸取25μl本品加入25μl待測類器官培養物中（加入體積與基質膠團混合物體積一致）；
c. 劇烈振蕩5min使類器官充分裂解；室溫放置25min以穩定發光信號，即可進行檢測；
d. 使用具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀進行化學發光檢測。請根據儀器要求設置相應的參數，每個孔的檢測時間一般為0.25-1s或更長時間，具體需根據儀器的檢測靈敏度進行適當的調整；
e. 根據化學發光讀數直接計算類器官的相對活力，或根據ATP標準曲線計算出ATP的量從而計算出類器官細胞的相對活力。類器官在0-30個類器官/孔的類器官密度范圍內有良好的線性關系，ATP標準品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關系；

注：檢測效果因類器官的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的類器官，在類器官數量達到100個后可能會不呈現線性相關，但化學發光讀數還是會繼續升高的。

（4）ATP 標準曲線的設置（選做）：

把自備的ATP標準溶液用PBS或類器官培養液稀釋成適當的濃度梯度。初次檢測可以設置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM這幾個濃度，24孔板每孔加入100μl的標準品。如有必要，在后續的實驗中可以根據類器官中的ATP含量對標準品的濃度范圍進行適當調整。如果用類器官培養液來稀釋ATP標準品，稀釋后需立即進行后續的發光檢測，否則培養液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導致ATP含量下降。

今天講解就到這了，大家如有類器官活力檢測問題，歡迎入群交流哦！

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