國自然熱點│自噬相關信號通路關鍵蛋白及研究策略

自噬的研究背景

關于自噬的研究曾獲得過兩次諾貝爾生理學或醫學獎。是比利時科學家克里斯汀·德·迪夫(Christian de Duve)因發現了在細胞自噬機制中起到重要作用的溶酶體，獲得1974年諾貝爾獎；其次是日本大隅良典團隊因探明了細胞自噬的啟動機制，獲得2016年諾貝爾獎。2023年，國家自然科學基金委員會揭曉的今年國自然評審結果，自噬相關研究的中標數量超500項（來源：ZCOOL國自然項目查詢系統）！

圖1 自噬研究進程

什么是自噬？

自噬是細胞在相關基因(autophagy related gene，Atg)的調控下利用溶酶體降解自身的細胞器和大分子物質的過程，以此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，是真核細胞的生命現象。簡單來說就是細胞自己吃自己、廢物再利用。自噬現象在機體的生理和病理過程中都會發生，常見的病理誘導因素包括：營養缺乏、能量代謝異常、缺血、缺氧、病原體感染等。

細胞自噬主要有三種形式：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy，通常也稱作自噬)和分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)，它們的主要不同之處在于產物（貨物）進入溶酶體的分子途徑（圖2）。

圖2 三種自噬途徑^[1]

在分子伴侶介導的自噬(CMA)中，具有KFERQ樣基序的蛋白質在Hsp70伴侶的幫助下通過LAMP-2A轉運蛋白轉運到溶酶體中。微自噬(microautophagy)涉及通過內陷溶酶體膜來隔離底物，而在巨自噬(macroautophagy)中，底物被吞噬在稱為自噬小體的雙層膜小泡中，自噬小體隨后與溶酶小體融合，提供其內容物以供降解。

自噬相關信號通路及關鍵蛋白

自噬過程受到不同自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)的調控, 據報道目前大約已有40個在酵母和哺乳動物中高度保守的自噬相關基因被發現。自噬發生需要經過以下幾個階段：自噬前體形成、自噬前體延長包裹自噬的底物形成自噬泡(Phagophore)、細長自噬泡關閉形成自噬體(Autophagosome)、自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體(Autolysosome)完成底物降解。

圖3 自噬過程^[2]

典型的自噬（巨自噬）如圖3所示，在營養缺乏等應激情況下，AMPK的激活或mTOR的抑制導致ULK的激活，ULK使Beclin-1磷酸化，導致VPS34的激活和吞噬細胞的形成。ULK在與FIP200和ATG13的復合體中發揮作用，而VPS34的功能需要一個調節亞基VPS15(P150)和Beclin-1，后者進一步調節其他調節因子如AMBRA、ATG14、UVRAG和BIF-1的聯系。多種ATG蛋白，如ATG5和ATG7，構成了兩個“泛素樣結合系統"，它們催化形成磷脂酰乙醇胺(PE)連接的LC3(LC3-II)，并將其正確地結合到吞噬體膜上。細長自噬泡的關閉標志著成熟自噬體的形成，自噬體最終與溶酶體融合，導致貨物降解、營養物質和代謝物的循環。

表1自噬不同階段關鍵蛋白及作用

細胞自噬研究策略

1、電鏡觀察自噬體的形成——自噬檢測金標準r

自噬體屬于亞細胞結構，需要使用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形態。電鏡檢測自噬主要是基于辨認自噬體結構特征（表2）。

表2 自噬不同階段形態特征

依照上述描述，能夠確認大部分自噬性囊泡，但有以下問題需要注意：

1）是否存在雙層或多層膜不能作為識別自噬體的依據（普通透射電鏡切片在制備過程中的處理可影響膜脂質成分，切片上的自噬體并非都是兩層膜結構，可能僅有一層膜，也可能是多層膜，有時膜結構可能因為脂質被提取而無法辨認）；
2）線粒體也含雙層膜，腫脹或含有沉淀物的線粒體外觀與自噬體形態相似，但仔細觀察，線粒體雙層膜間距一般較小且均一，線粒體內膜折疊形成嵴，而自噬體內膜不會折疊；
3）粗面內質網有時會包繞線粒體等細胞器，容易誤認為自噬體，根據內質網上有核糖體而自噬體膜上無核糖體可鑒別；
4）切片上的電子密度低或空泡有時也會被誤認為自噬囊泡。

2、Western blot檢測自噬相關蛋白

在進行自噬研究時，提取蛋白進行Western Blot，檢測LC3-I和LC3-II幾乎是必做的實驗。細胞內存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，分布于細胞漿內。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)偶聯形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內膜和外膜，并穩定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合。因此，LC3-Ⅱ被用來作為自噬體的標記，其表達水平在某種程度上反映了自噬體的數量^[3]。LC3-I/II的形成和降解是一個動態過程，瞬時LC3-Ⅱ表達不能反映自噬程度，需配合使用工具化合物分析自噬變化。

除了檢測自噬標志物LC3的轉換(LC3-II/LC3-I)外，還可以用Western Blot實驗檢測Beclin1、P62等自噬相關蛋白的表達情況。Western blot操作包括：總蛋白提取→蛋白含量測定→SDS-PAGE電泳→電轉→封閉→抗體孵育→化學發光成像。就操作難度而言，Western blot在一眾實驗中排名靠前，WB實驗具體步驟可參考我們往期分享。

3、自噬的實驗性調控——工具化合物

通過人為的干預來激活或者抑制自噬功能后觀察細胞行為或效應分子的變化能夠使研究結論更具有說服力。目前，常用的抑制自噬及誘導自噬的藥物及機制如表3所示。需要注意的是，這些工具藥普遍存在的缺陷就是特異性不強，在抑制自噬的同時對細胞其他代謝過程也可能會有影響。如3-MA抑制ClassⅢ PI3K的同時對ClassⅠ PI3K同樣也有抑制作用，繼而抑制Akt/mTOR通路，激活自噬。

表3 細胞自噬常用的激活劑和抑制劑

4、應用 GFP-LC3 轉基因小鼠實現體內自噬的實時監測

Tian等^[4]利用GFP-LC3轉基因小鼠，借助于體內成像技術經顱骨檢測實驗性腦卒中后缺血腦組織區域GFP熒光強度，與體外自噬成像、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)檢測、蛋白印跡分析、免疫組織化學、免疫熒光等分析方法結果相似。該研究提供了活體自噬檢測的證據，展示了一種在活體動物模型中檢測體內自噬的方法，此方法對監測活體中風患者體內的自噬過程以及闡明自噬在腦缺血和其他神經疾病中的詳細作用具有重要價值。

圖4 腦缺血區頭部活體成像監測GFP熒光信號

自噬研究已成為當前生命科學研究的熱點，揭示自噬的發生機制、自噬與疾病發生的關系對預防與治療多種人類重大疾病具有重要意義。然而，至今并沒有非常準確可靠的自噬功能檢測和監控方法，我們在進行自噬相關研究時應結合不同的檢測原理，借助不同的檢測技術進行分析，體內外結果互相驗證以避免單一技術的局限性。

[1] Duraes F V , Jennifer N , Juan D ,et al.Macroautophagy in Endogenous Processing of Self- andPathogen-Derived Antigens for MHC Class II Presentation[J].Frontiers in Immunology, 2015, 6. DOI:10.3389/fimmu.2015.00459.
[2] Michelle Cicchini; Vassiliki Karantza; Bing Xia.Molecular Pathways: Autophagy in Cancer-A Matter of Timing and Context[J].Clinical Cancer Research.2015,21 (3): 498-
[3] Kimura S, Fujita N, Noda T, et al. Monitoring autophagy inmammalian cultured cells through the dynamics of LC3. Methods Enzymol, 2009, 452: 1-12.

[4] Tian F, Deguchi K, Yamashita T, et al. In vivo imaging of autophagy in a mouse stroke model. Autophagy, 2010, 6(8): 1107-1114.

自噬激活劑：

自噬抑制劑：

自噬相關抗體：

溫馨提示：absin所有產品僅用于科學研究，請勿藥物、家用或其他用途。

好消息！Absin文獻獎勵重磅升級！

Absin特色產品線：

WB相關：ECL發光液、預染marker、預制膠；IHC相關：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...