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                分子實驗之如何保證樣本核酸穩定?

                更新時間:2023-11-17      點擊次數:1509

                科研狗起早摸黑做了幾天分子克隆實驗,

                本想著拖了好幾個星期的實驗終于要做完啦!瞬間覺得自己棒棒噠!

                但是最后看實驗結果!!! 原地裂開


                 

                排查實驗試劑,沒問題!

                排查實驗操作,沒問題!

                排查儀器,沒問題!

                那么問題到底出在哪呢?


                 

                其實問題有可能出現在樣本保存與前處理步驟中哦。生物樣本中的核酸(DNA/RNA)會因為核酸酶、溫度、pH值、微生物、自身化學性質等因素而發生被動或主動降解,從而導致分子實驗結果不盡人意。目前針對不同科研的需求,更多的樣本保存方式也相繼問世,小愛為大家匯總了各類樣本保存的步驟、注意事項、以及樣本保存耗材或保存液的推薦。


                一、實驗樣本主要類型:

                 

                分子實驗中主要的樣本類型有:純核酸類、組織類、細胞類及環境類。不同樣本具有不同的保存方式以及操作注意事項。


                圖1 常見的實驗樣本類型

                 

                表1 不同類型樣本核酸保存方法及穩定性


                類型

                檢測目標

                穩定性及保存注意事項

                組織

                DNA/RNA

                新鮮組織應盡快加入到含有核酸保護劑的管中,放置于冰上運輸至實驗室;石蠟包埋組織中的核酸在室溫即可保持穩定。

                血液

                全血的DNA/RNA

                DNA:全血室溫可穩定保存24h,2-8℃穩定保存72h,-20℃可長期保存

                RNA:室溫不建議保存,樣本應至于含有核酸穩定劑的管中,放置于冰上運輸至實驗室。

                血清/血漿的cfDNA/ctDNA/病毒DNA/病毒RNA

                cfDNA:2-8℃,8h內分離血漿,-20℃或更低溫度穩定保存;

                ctDNA:抽血后4-5h內即需要完成核酸提取;

                病毒DNA:2-8℃穩定一周,-20℃穩定一年以上;

                病毒RNA:2-8℃,6h內分離血漿,-20℃或更低溫度保存

                干血片的DNA

                室溫穩定保存19個月,需要注意防潮。

                細胞

                DNA/RNA

                37℃保持細胞活力即可。

                骨髓

                RNA

                必須在采集后立即至于RNA穩定劑中,或者于液氮中速凍

                胸水、腦水、腦脊液等其他生物體液樣本

                DNA

                低溫(2-8℃)保存,盡快提取檢測。




                 

                二、實驗樣本前處理步驟及注意事項

                 

                1、組織樣本:


                塊狀組織樣本短時間內無法充分裂解,一般需要進行樣本預處理。組織取材在組織離體30min內完成,取樣的動作要盡量快速利索,將組織按任一方向切成黃豆粒大小。


                組織DNA提取:新鮮組織樣本用生理鹽水清洗2次,即刻進行實驗。如若不立即進行實驗,可用液氮速凍,-80℃凍存。


                組織RNA提取:將動物或植物組織切成小塊,在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理,快速轉入裝有1mL Trizol(abs60154)的2mL離心管中,立即進行實驗。若后期再進行實驗,盡量保存時將樣本浸入RNA樣品保存液(abs9268)后置4℃冰箱過夜(4℃過夜是必需的,這樣可使RNA樣品保存液滲入到組織中),然后轉移到-20℃冰箱。或者液氮研磨組織,加入Trizol,放入-80℃保存。


                圖2 組織樣本RNA提取流程圖

                 

                2、細胞樣本:


                DNA提取:細胞收集沉淀后,進行液氮速凍,-80℃保存。


                RNA提取:

                1)貼壁細胞:吸盡培養液,每10cm2培養面積加入1mL Trizol,用加樣器吹打數次,以確保細胞裂解,然后轉移至離心管中。注:貼壁細胞Trizol的使用量應由培養皿表面積決定,而非由細胞數目決定。Trizol量不足可能導致提取的RNA中有DNA污染;
                2)懸浮細胞:離心收集細胞,吸盡液體,每5-10×106動植物或酵母細胞,或每1×107細菌細胞加入1mL Trizol,用加樣器吹打,使其裂解,然后轉移至離心管中。 注:添加Trizol前切勿洗滌細胞,以免RNA降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞。若后期再進行RNA提取實驗,細胞用液氮速凍,-80℃凍存。

                 

                3、血液樣本:


                采用含有抗凝劑的真空采血管保存即可。但采血管中的抗凝劑種類多樣,抗凝劑的種類也會直接影響后續檢測結果,面對這么多的采血管如何進行選擇?我們建議使用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管,不建議使用肝素抗凝管(因肝素在后面的核酸提取過程中很難去除,且肝素對PCR反應有很強的抑制作用,因此不建議使用肝素抗凝管)。采集完血液,顛倒混勻備用。另外冰凍血液溶解過程中會有破碎的細胞釋放RNA酶,因此在冰凍前加入Trizol,切勿直接凍存新鮮血液,保存好的血液應避免反復凍融。

                 

                4、血清/血漿樣本:


                全血不加抗凝劑分離的上清是血清,加入抗凝劑分離的上清是血漿。取全血后,靜止1-2h,置于離心機3000rpm離心15min即可獲得血清或血漿。


                三、樣本前處理利器—RNA樣品保存液(abs9268)

                 

                RNA樣品保存液是一種無毒的可直接使用的樣品儲存液,能使細胞內的RNARNA酶分離,防止樣本中RNA表達譜發生變化。加入樣本保存液的樣本中RNA在室溫可以保存7天4℃可以保存4周-20℃-80℃標本可以長期保存。在RNA樣品保存液中保存的標本,反復凍融至室溫20次不影響RNA的質量。

                 

                操作步驟:

                1)計算保存液用量:根據要保存的各樣本的體積,計算出所需RNA樣品保存液用量;a:RNA樣品保存液的用量應當是組織體積的10倍(100mg組織約用1mL RNA樣品保存液);b:離心收集2×107細胞RNA樣品保存液的用量是1mL;
                2)分裝:RNA樣品保存液按需要量分裝入自備保存管中;
                3)切片:快速將較大的組織切成厚度<0.5cm的任意片狀,較小的組織直接取下,立即浸入RNA樣品保存液中;
                4)保存:保存時先將樣本浸入RNA樣品保存液后置4℃冰箱過夜,然后轉移到-20℃冰箱或繼續轉移至-80℃冰箱。


                四、本期小愛產品推薦


                貨號

                產品名稱

                規格

                abs9268

                RNA樣品保存液

                100mL

                abs9474

                組織保存液

                100mL

                abs60150

                RNA酶抑制劑

                2000U

                abs60154

                Trizol

                100mL

                abs9259

                無酶無菌水(DEPC水)

                500mL





                 



                Absin特色產品線:

                WB相關:ECL發光液、預染marker、預制膠;IHC相關:二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體;定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

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