6小時完成8指標染色？！mIHC技術(shù)大盤點

2022年，“生物大分子與微生物組"被列為國自然重點項目，由此掀起了空間蛋白組學技術(shù)的研究熱潮，其中免疫組織化學（IHC，Immunohistochemistry）作為最早的空間蛋白組學技術(shù)，衍生出了很多新興的研究方法。IHC是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑顯色以確定細胞內(nèi)抗原，并對其進行定位、定性及定量的研究。

隨著空間蛋白組學技術(shù)的不斷發(fā)展，利用IHC進行的傳統(tǒng)多標記方案，也就是在連續(xù)切片上進行單標染色，很明顯已經(jīng)不能適用于研究人員的高通量檢測需求。于是，mIHC技術(shù)就應(yīng)運而生了，它可以做到在一個樣本中進行多重熒光染色。相比于傳統(tǒng)的組化技術(shù)，mIHC在復雜的腫瘤微環(huán)境中蛋白表達和共定位分析或其他生理過程中有較高應(yīng)用價值，尤其是在樣本數(shù)較少的情況下，可以做到同時檢測多達10種熒光染料。

目前，mIHC有兩大技術(shù)——經(jīng)典的TSA技術(shù)和新興的SignalStar技術(shù)。那么，這兩種技術(shù)我們該怎么去選擇呢？接下來就帶大家一起來看看吧～

Part 01 TSA技術(shù)簡介

1．TSA技術(shù)原理

酪氨酸信號放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術(shù)，是利用辣根過氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 對靶蛋白進行高密度原位標記的酶學檢測方法。簡單來說，就是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合；然后微波清洗，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。

圖1 TSA技術(shù)原理圖

2. TSA操作步驟

1）使用TSA技術(shù)，你需要準備：嚴格驗證的高特異性抗體、HRP偶聯(lián)的針對一抗種屬亞型特異的二抗、酪胺熒光素、多光譜成像系統(tǒng)；

2）孵育一抗二抗：利用二抗上帶有的HRP催化后續(xù)添加入體系的非活性酪胺熒光素；

3）加入酪胺：酪胺熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合；

4）微波清洗：通過微波清洗去除已連接的一抗和二抗，共價結(jié)合的熒光素還留存在樣品上，再孵育新的靶點的一抗和二抗；

5）檢測：等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，使用熒光顯微鏡檢測結(jié)果。

相關(guān)產(chǎn)品推薦：

Part 02 SignalStar™ Multiplex IHC技術(shù)簡介

1.  SignalStar技術(shù)原理

SignalStar技術(shù)是使用帶有寡核苷酸標簽的特異性抗體，結(jié)合du有的信號放大系統(tǒng)并使用熒光成像檢測的多重免疫組化（mIHC) 技術(shù)，可在常規(guī)FFPE樣本中同時檢測3-8個靶標蛋白，且兼容常見下游成像平臺及分析軟件。

圖2 對石蠟包埋的人胃腺癌進行 SignalStar™ 多重免疫組化分析結(jié)果圖

2.  SignalStar操作步驟

1）將寡核苷酸偶聯(lián)的抗體加入到經(jīng)過脫蠟，復水以及抗原修復處理的FFPE組織中；

2） 一次添加所有抗體，然后進行溫和固定；

3）互補寡核苷酸與前4個抗體的偶聯(lián)標簽雜交；

4）使用熒光寡核苷酸產(chǎn)生并放大信號(AF488, AF594, AF647, AF750)；

5）寡核苷酸連接；

6）寡核苷酸特異性酶去除所有熒光信號；

7）互補寡核苷酸與偶聯(lián)抗體上的寡核苷酸標簽進行第二輪雜交；

8）使用熒光寡核苷酸產(chǎn)生并放大信號(AF488, AF594, AF647, AF750)；

9）寡核苷酸連接。

圖3 SignalStar™實驗流程圖

Part 03 TSA 技術(shù)vs SignalStar技術(shù)

TSA技術(shù)與SignalStar技術(shù)各有優(yōu)缺點，對比如下：

對于研究者來說，進行mIHC實驗需要準備抗體和多重熒光二抗試劑盒，可以提供4-7色的多色試劑盒及輔助試劑。除此之外，我們還可提供mIHC整體解決方案，包括試劑、服務(wù)等等。其中，愛必信多色服務(wù)最多九指標十色（含DAPI）的多重熒光免疫組化服務(wù)，樣本種屬涵蓋人、小鼠、大鼠、豬等；組織類型以腫瘤樣本居多，涵蓋肺、胃、肝、腎、腸等各大器官，甲狀腺、胰腺、唇腺、淚腺等各大腺體，另還有眼球、神經(jīng)、大腦等特殊樣本；切片類型涵蓋石蠟切片、組織芯片（TMA）、冰凍切片、大組織切片、厚切片等，并提供全片掃描和定量分析。

圖4 Absin全景多靶點染色成像分析平臺

Part 04常見問題解答

Q1：波修復抗原每一輪染色都要做嗎？可以用抗體洗脫液替代嗎？抗體洗脫液用在哪個步驟？

A1：染第一個抗體之前做抗原修復，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識別到抗原；在染后面每一個抗體之前的抗原修復，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒有結(jié)合上的染料，其實更準確的叫法是“抗體洗脫"，也就是說第一次的抗原修復是真正的抗原修復，后面的抗原修復實際上是“抗體洗脫"，“抗體洗脫"可以用抗體洗脫液(abs994)替換，特別是細胞、冰凍切片或者骨樣本，但第一次抗原修復不能被抗體洗脫液替代，冰凍切片可以不進行抗原修復，染色效果欠佳時，可以考慮嘗試進行抗原修復，推薦冰凍切片快速抗原修復液(5×)(abs9207)。

Q2：脫蠟水合步驟中“10%中性福爾馬林浸片10min，滅菌水洗片1min，重復3次"目的是什么？我們以前做石蠟切片的時候沒有這一步。

A2：這是后固定的步驟，固定充分的組織可以省略此步。

Q3：做好的多色片子，無法進行及時掃描，該如何保存？

A3：需要避光防震，在4℃條件下保存。

Q4：樣本可以做成冰凍切片嗎？

A4：可以的?？乖迯筒襟E不推薦用加熱的方法，推薦用抗體洗脫液(abs994)

Q5：所有操作要避光嗎？

A5：不需要，在常規(guī)環(huán)境下操作就可以，染料的熒光強度很高。

Q6：抗體修復液每一輪修復都要更換嗎？

A6：是的，每一輪都要根據(jù)抗體選擇相應(yīng)的修復液。

Q7：染料的選擇會影響后染色嗎，有共定位的話怎么辦？

A7：共定位的情況，我們可以通過單一通道觀察來更好的檢測各指標的分布情況，染料不會對染色有影響，串色的情況需要預(yù)實驗做充足，包括抗體稀釋比例，染料與放大液比例，修復條件的確定。

Q8：多色用的一二抗各是什么種屬？

A8：多色的優(yōu)勢在于一二抗種屬無需特別要求，一抗根據(jù)樣本種屬選擇既可，二抗根據(jù)一抗選擇即可，多個抗體組合，種屬不會有影響。

Q9：抗體洗脫和微波修復哪種方式洗脫效果更好？

A9：微波修復洗脫更穩(wěn)定，抗體洗脫液對大多數(shù)抗體都管用，難洗的抗體延長洗脫時間就可以啦！

Q10：我的組織還有GFP蛋白，給結(jié)果的時候能排除干擾嗎？

A10：可以的，結(jié)果分析的時候可以避免綠色通道，分析軟件賦予的顏色是偽彩色，可以更換其他顏色。

Q11：在指標與染料的搭配以及染色順序上，有什么規(guī)律嗎？

A11：并沒有一個特別的線性關(guān)系，和蛋白的種類、表達量以及修復條件都有關(guān)系，所以會多因素考慮，多嘗試，預(yù)實驗很重要。