答應我，看完再做IHC（上）

IHC實驗是科研人bi備的實驗技能之一，然而IHC實驗流程復雜，而且經常出現假陰性的結果，常常讓人頭疼。為此特別給大家整理了一份IHC實驗詳解，原理，步驟，注意事項及操作視頻一網打盡，想做IHC實驗只看這篇就夠了（分為上下兩篇哦）。

IHC實驗原理

免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)：利用抗原－抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色以確定細胞內抗原，并對其進行定位、定性及定量的研究。和WB實驗相比，IHC實驗可以更為直觀的展現待測蛋白的表達量和位置，也常用于病理診斷。

表1 WB實驗和IHC實驗比較

IHC樣本類型

IHC實驗根據樣本類型可以分為石蠟切片免疫組化(IHC-P)和冰凍切片免疫組化(IHC-F)，石蠟切片免疫組化雖然操作更加復雜，但其可以更好的保持組織的形態結構，厚度更薄便于染色和觀察，以及可以常溫保存多年的優點，在實驗中更為常用。IHC-P和IHC-F的區別如下表：

表2 IHC-P和IHC-F實驗比較

IHC實驗流程

IHC-P由于前期需要用醛類固定和石蠟包埋，因此前期樣品處理時需要有脫蠟復水和抗原修復的步驟，IHC-F則可以直接用OCT包埋劑包埋進行切片和固定，可省略抗原修復的過程，后面的步驟基本一致。IHC-P的實驗步驟如下圖所示：

PART 1 樣本制備

（篇幅有限，本文僅介紹樣本制備過程，后面的流程將在以后繼續介紹）
石蠟組織樣本的制備流程和冰凍組織樣本略有不同，步驟可參考下圖：
 

1、石蠟組織樣本：

（1）固定：可以使用4%多聚甲醛進行在體灌流的方式，或者把組織取出之后，盡快放入4%多聚甲醛或者10%中性福爾馬林中進行固定。固定液的體積一般為組織體積的20倍，固定時間為室溫4-48h。組織的體積不宜過大（不超過5*5mm2），以免影響后續的操作；

（2）脫水透明：使用梯度乙醇和二甲苯對樣品進行脫水和透明處理。將組織修剪后置于脫水盒內，依次放置于以下溶液中：75%乙醇（1h）——85%乙醇（1h）——95%乙醇（1h）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）；

（3）浸蠟包埋：脫水結束后放入預熱的包埋機，按要求確定包埋方向進行包埋，置于冷凍臺冷卻；

（4）切片：將修整好的蠟塊放入切片機中進行切片，切片的厚度為3-5um，將切片漂浮于40℃溫水上展平組織，用粘附載玻片將組織撈起，置于60℃烘箱中進行烤片1-2h；

（5）脫蠟復水：使用二甲苯和梯度乙醇進行脫蠟和復水處理。將切片放置于切片架內，依次分別置于以下溶液中：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min)；

（6）抗原修復：

組織樣本在固定時形成的蛋白間交聯會限制抗體和抗原結合，需要通過抗原修復的過程使抗原暴露出來。抗原修復的方法一般分為熱修復和酶解修復。

熱修復：熱修復可使用微波爐或高壓鍋對樣品進行加熱煮沸，常用的緩沖液為PH6的檸檬酸鹽或者PH8的EDTA緩沖液。熱修復適用于大多數實驗，檸檬酸鹽較為溫和，更為常用；EDTA適用于多數磷酸化酪氨酸特異性抗體和較難檢測出的抗原。（具體修復液的選擇和處理時間參考一抗說明書）

酶解修復：胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K進行酶解作用也可進行抗原修復。酶解修復易受溫度影響，操作更難控制，一般適合于較難修復的抗原表位。
操作步驟：將切片置于切片架內，放入裝有修復液的燒杯中，放入微波爐高火5-8min，常溫5min，中火5min，室溫冷卻30min。

2、冰凍組織樣本：

（1）OCT包埋：-80℃保存的組織提前半小時-20℃緩慢解凍后OCT包埋，固定組織經蔗糖溶液脫水后進行OCT包埋，新鮮組織濾紙吸干水分后可直接進行OCT包埋。樣本脫上滴少量OCT后，將組織切面朝上置于樣本脫上，組織周圍滴上OCT包埋劑全部覆蓋組織，將樣本托放在速凍臺上快速冷凍包埋，大約冷凍10-20min，OCT變白變硬后即可進行切片。

（2）切片：將樣本托固定于切片機上，先粗修將組織面修切平整修到目的觀察部位后即可開始切片，將組織貼于防脫載玻片上，室溫晾干，37℃烤箱烘烤10-20min。

（3）固定：用4%PFA或者甲醇固定20min。