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                免疫細胞培養攻略之擴增&培養(四)

                更新時間:2024-09-13      點擊次數:120

                概述


                免疫細胞培養的六個基本流程:樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養、質量優化、后續研究。小愛已經給大家詳細介紹了《免疫細胞培養攻略之樣本制備(一)》《免疫細胞培養攻略之細胞分選(二)》《免疫細胞培養攻略之分型鑒定(三)》今天我們繼續一起學習擴增&培養的相關知識。


                從樣本制備到細胞分選、分型鑒定,我們終于獲得了純度高、活性好的目的細胞之后,便需要在體外人工模擬其在體內的生長環境,同時保證無菌、適宜的溫度和pH,給予免疫細胞充足的營養使其不斷生長繁殖,這個過程便是擴增&培養,主要可分為培養體系建立、傳代流程、凍存和復蘇


                擴增&培養


                1、培養體系建立:


                不同免疫細胞涉及的細胞因子、激活信號大不相同,因此培養體系也不可同一而論;同一免疫細胞不同來源(如PBMC來源、臍帶血來源、iPSCs或ESCs)的具體培養方案也存在差別。小愛列舉了一些免疫細胞的培養體系以作參考,大家可以針對自己的實驗需求進行摸索和優化,以獲得擴增效率高、細胞純度高、活性好的最佳培養方案。


                (1)T細胞(human)的活化、增殖培養與分化:


                T細胞的激活涉及到兩個信號:TCR/CD3與APC表面特異的MHC-多肽復合物結合產生的特異性抗原刺激信號;APC表面多對共刺激分子和T細胞相應受體作用后產生的非特異性的共刺激信號。最常見的用于T細胞體外活化的是Anti-CD3和Anti-CD28,在兩者的協同作用下,可使T細胞充分活化[1]。此外,我們還需添加不同的細胞因子以誘導T細胞向不同的方向分化(圖1)。


                免疫細胞培養攻略之擴增&培養(四)

                圖1 細胞因子在T細胞中的調節和功能[2]


                1.將免疫細胞無血清培養基(abs9772)恢復至室溫,重懸分離后的T細胞,加入CD3/CD28磁珠(abs160019)(與細胞數量1:1),1%雙抗(abs9244),促進T細胞活化和增殖;

                2.加入300U/mL IL-2(abs04045)使其分化和增殖為效應T細胞;或5ng/mL IL-15促使T細胞分化和增殖為記憶T細胞[3]


                以上是一篇文獻的T細胞分化方案,小愛也匯總了體外誘導T細胞分化的一些細胞因子(圖2),可供大家參考。


                subtype

                cytokine

                medium

                culture time

                Th1

                IL-2+IL-12

                RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IL-4+5ng/mL IL-2+10 ng/mL IL-12+55μM β-mercaptoethanol

                96h

                Th2

                IL2+IL4

                RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+5ng/mL IL-2+10ng/mL IL-4+55μM β-mercaptoethanol

                96h

                Th17

                IL-6+TGFβ

                RPMI1640+10%FBS+2μg/Ml Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+1μg/mL Anti-IL-2+1μg/mL Anti-IL-4+20 ng/mL IL-6+1ng/mL TGFβ1+55μM β-mercaptoethanol

                96h

                Treg

                TGFβ1

                RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+1μg/mL Anti-IL-4+1ng/mL TGFβ1+55μM β-mercaptoethanol

                96h


                圖2 體外誘導T細胞分化方案[4]


                Tips:原代T細胞一般在體外的培養時間不超過三周,用于功能實驗的T細胞建議培養時間在14天以內。


                (2)PBMC(human)來源的NK細胞體外擴增[5]

                1.調整分離后的NK細胞密度為1*106cells/mL,重懸至含有免疫細胞無血清培養基(abs9772)中;

                2.加入200U/mLIL-2,10ng/mL IL-15和1*106cells/mL的K562細胞(絲裂mei素處理滅活)。在15天的擴增過程中,每隔2-3天對NK細胞進行一次傳代,補充細胞因子和新鮮制備的K562細胞。

                當然,PBMC(human)來源的NK細胞體外擴增的方法有很多:細胞因子?抗體融合、飼養細胞或膜顆粒。小愛也找到一篇24.1分的綜述,詳細列舉了不同擴增方案的培養基、添加物、培養天數、擴增效率、細胞純度,大家可以按需保存!


                免疫細胞培養攻略之擴增&培養(四)

                圖2 PBMC(human)來源的NK細胞體外擴增方案[6]


                (3)單核細胞(human)的培養以及誘導分化為巨噬細[7]

                1.向免疫細胞無血清培養基(abs9772) 加入1%雙抗(abs9244),10%胎牛血清優級(abs972),使用上述培養基將分離的單核細胞重懸,細胞密度為1x106cells/mL,放入37°C、5%CO2的培養箱中,等待1h左右使細胞貼壁;

                2.單核細胞經培養后即開始分化為廣義M0巨噬細胞。接種后第三天,更換新鮮培養基并加入25ng/mL粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),以促進M1表型,或50ng/mL巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF),以促進M2表型。第六天,可再次更換新鮮培養基并加入100ng/mL LPS和20ng/mL IFN-γ,使細胞極化為M1-巨噬細胞表型,或加入10ng/mL M-CSF和20ng/mL IL-4;繼續培養24h即可。


                (4)樹突狀細胞的培養[8]

                1.樹突狀細胞體外培養時一般不增殖,可在培養環境中存活1周或更長時間。如果細胞需要持續培養超過一夜,建議在免疫細胞無血清培養基(abs9772)添加500U/mL GM-CSF和500U/mL IL4,以確保維持DC表型。

                2.樹突狀細胞在10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β、15ng/mL IL-6和10ug/mL前列腺素E2(Prostaglandin E2)或0.2U/mL肝素(Heparin)和50μg/mL血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)或0.2U/mL肝素(Heparin)中可分化為成熟的樹突狀細胞。


                2、傳代流程


                貼壁性好的免疫細胞


                免疫細胞培養攻略之擴增&培養(四)


                半貼壁性細胞和懸浮細胞


                免疫細胞培養攻略之擴增&培養(四)


                3、凍存與復蘇[9]


                (1)凍存:在細胞密度達到107cells/mL時可進行凍存,采用分步冷凍法。具體步驟如下:

                1.懸浮細胞500g室溫離心10min收集細胞沉淀,貼壁細胞胰酶消化并終止后離心收集;

                2.棄上清,凍存液重懸細胞沉淀,1mL分裝并做好標記;

                3.將凍存管放置-20℃ 1h;-80℃過夜;轉移至液氮中進行長期保存。


                (2)復蘇:

                1.從液氮中取出細胞,37℃水浴快速解凍細胞;

                2.將細胞轉移到含有12mL培養基的15mL離心管中;

                3.500g室溫離心5min,棄上清;

                4.加入培養基重懸細胞進行后續的培養。

                Tips:復蘇的免疫細胞建議通過血細胞計數計算細胞懸液中的細胞數量,并通過臺盼藍染料測定細胞活力。


                今天講解就到這了,下一個質量優化,我們不見不散呀!大家如有細胞培養問題,歡迎一起交流哦!


                參考文獻:

                [1] Gunnlaugsdottir, B., Anti-CD28-induced co-stimulation and TCR avidity regulates the differential effect of TGF- 1 on CD4+ and CD8+ naive human T-cells.International Immunology, 2004. 17(1): p. 35-44.

                [2] Dong, C., Cytokine Regulation and Function in T Cells.Annual Review of Immunology, 2021. 39(1): p. 51-76.

                [3] Nguyen, D.N., et al., Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nature Biotechnology, 2019. 38(1): p. 44-49.

                [4] Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.

                [5] Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency.Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).

                [6] Fang, F., et al., Advances in NK cell production.Cellular & Molecular Immunology, 2022. 19(4): p. 460-481.

                [7] K. Plaisance-Bonstaff, C.F., D. Wyczechowska, et al., Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes.J Vis Exp, 2019(154): p. 10.3791/59967.

                [8] Boudewijns, S., et al., Autologous monocyte-derived DC vaccination combined with cisplatin in stage III and IV melanoma patients: a prospective, randomized phase 2 trial.Cancer Immunology, Immunotherapy, 2020. 69(3): p. 477-488.

                [9] Raulf, M., T Cell: Primary Culture from Peripheral Blood, in Allergy. 2019. p. 17-31.

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                貨號

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                規格

                abs9772

                免疫細胞無血清培養基

                1L

                abs04045

                Recombinant Human IL-2 Protein

                10ug/50ug/100ug

                abs160019

                CD3/CD28磁珠

                1.5mL×4/1.5mL×8

                abs972

                胎牛血清(優級)

                500mL

                abs9244

                青霉素-鏈霉素溶液(100×,雙抗)

                100mL

                abs04123

                Recombinant Human IFN-γ Protein

                10ug/50ug/100ug/500ug/1mg

                abs04698

                Recombinant Human IL-4 Protein

                10ug/100ug/500ug

                abs04079

                Recombinant Human IL-13 Protein(C-6His)

                10ug/50ug/500ug/1mg

                abs7011

                25cm2細胞培養瓶(50mL,透氣蓋)

                200個/箱

                abs7033

                細胞培養板(標準透明6孔板)

                50個/箱

                abs7054

                25mL一次性血清移液管

                200支/箱





                Absin產品線:

                爆款產品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測);細胞培養(類器官試劑盒+基質膠,胎牛血清+培養添加劑+細胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

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