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                免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之?dāng)U增&培養(yǎng)(四)

                更新時(shí)間:2024-09-13      點(diǎn)擊次數(shù):781

                概述


                免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程:樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備(一)》《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選(二)》《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定(三)》今天我們繼續(xù)一起學(xué)習(xí)擴(kuò)增&培養(yǎng)的相關(guān)知識(shí)。


                從樣本制備到細(xì)胞分選、分型鑒定,我們終于獲得了純度高、活性好的目的細(xì)胞之后,便需要在體外人工模擬其在體內(nèi)的生長環(huán)境,同時(shí)保證無菌、適宜的溫度和pH,給予免疫細(xì)胞充足的營養(yǎng)使其不斷生長繁殖,這個(gè)過程便是擴(kuò)增&培養(yǎng),主要可分為培養(yǎng)體系建立、傳代流程、凍存和復(fù)蘇


                擴(kuò)增&培養(yǎng)


                1、培養(yǎng)體系建立:


                不同免疫細(xì)胞涉及的細(xì)胞因子、激活信號(hào)大不相同,因此培養(yǎng)體系也不可同一而論;同一免疫細(xì)胞不同來源(如PBMC來源、臍帶血來源、iPSCs或ESCs)的具體培養(yǎng)方案也存在差別。小愛列舉了一些免疫細(xì)胞的培養(yǎng)體系以作參考,大家可以針對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行摸索和優(yōu)化,以獲得擴(kuò)增效率高、細(xì)胞純度高、活性好的最佳培養(yǎng)方案。


                (1)T細(xì)胞(human)的活化、增殖培養(yǎng)與分化:


                T細(xì)胞的激活涉及到兩個(gè)信號(hào):TCR/CD3與APC表面特異的MHC-多肽復(fù)合物結(jié)合產(chǎn)生的特異性抗原刺激信號(hào);APC表面多對(duì)共刺激分子和T細(xì)胞相應(yīng)受體作用后產(chǎn)生的非特異性的共刺激信號(hào)。最常見的用于T細(xì)胞體外活化的是Anti-CD3和Anti-CD28,在兩者的協(xié)同作用下,可使T細(xì)胞充分活化[1]。此外,我們還需添加不同的細(xì)胞因子以誘導(dǎo)T細(xì)胞向不同的方向分化(圖1)。


                免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之?dāng)U增&培養(yǎng)(四)

                圖1 細(xì)胞因子在T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)和功能[2]


                1.將免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)恢復(fù)至室溫,重懸分離后的T細(xì)胞,加入CD3/CD28磁珠(abs160019)(與細(xì)胞數(shù)量1:1),1%雙抗(abs9244),促進(jìn)T細(xì)胞活化和增殖;

                2.加入300U/mL IL-2(abs04045)使其分化和增殖為效應(yīng)T細(xì)胞;或5ng/mL IL-15促使T細(xì)胞分化和增殖為記憶T細(xì)胞[3]


                以上是一篇文獻(xiàn)的T細(xì)胞分化方案,小愛也匯總了體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化的一些細(xì)胞因子(圖2),可供大家參考。


                subtype

                cytokine

                medium

                culture time

                Th1

                IL-2+IL-12

                RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IL-4+5ng/mL IL-2+10 ng/mL IL-12+55μM β-mercaptoethanol

                96h

                Th2

                IL2+IL4

                RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+5ng/mL IL-2+10ng/mL IL-4+55μM β-mercaptoethanol

                96h

                Th17

                IL-6+TGFβ

                RPMI1640+10%FBS+2μg/Ml Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+1μg/mL Anti-IL-2+1μg/mL Anti-IL-4+20 ng/mL IL-6+1ng/mL TGFβ1+55μM β-mercaptoethanol

                96h

                Treg

                TGFβ1

                RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+1μg/mL Anti-IL-4+1ng/mL TGFβ1+55μM β-mercaptoethanol

                96h


                圖2 體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化方案[4]


                Tips:原代T細(xì)胞一般在體外的培養(yǎng)時(shí)間不超過三周,用于功能實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞建議培養(yǎng)時(shí)間在14天以內(nèi)。


                (2)PBMC(human)來源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增[5]

                1.調(diào)整分離后的NK細(xì)胞密度為1*106cells/mL,重懸至含有免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)中;

                2.加入200U/mLIL-2,10ng/mL IL-15和1*106cells/mL的K562細(xì)胞(絲裂mei素處理滅活)。在15天的擴(kuò)增過程中,每隔2-3天對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行一次傳代,補(bǔ)充細(xì)胞因子和新鮮制備的K562細(xì)胞。

                當(dāng)然,PBMC(human)來源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法有很多:細(xì)胞因子?抗體融合、飼養(yǎng)細(xì)胞或膜顆粒。小愛也找到一篇24.1分的綜述,詳細(xì)列舉了不同擴(kuò)增方案的培養(yǎng)基、添加物、培養(yǎng)天數(shù)、擴(kuò)增效率、細(xì)胞純度,大家可以按需保存!


                免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之?dāng)U增&培養(yǎng)(四)

                圖2 PBMC(human)來源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方案[6]


                (3)單核細(xì)胞(human)的培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)[7]

                1.向免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772) 加入1%雙抗(abs9244),10%胎牛血清優(yōu)級(jí)(abs972),使用上述培養(yǎng)基將分離的單核細(xì)胞重懸,細(xì)胞密度為1x106cells/mL,放入37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中,等待1h左右使細(xì)胞貼壁;

                2.單核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后即開始分化為廣義M0巨噬細(xì)胞。接種后第三天,更換新鮮培養(yǎng)基并加入25ng/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF),以促進(jìn)M1表型,或50ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF),以促進(jìn)M2表型。第六天,可再次更換新鮮培養(yǎng)基并加入100ng/mL LPS和20ng/mL IFN-γ,使細(xì)胞極化為M1-巨噬細(xì)胞表型,或加入10ng/mL M-CSF和20ng/mL IL-4;繼續(xù)培養(yǎng)24h即可。


                (4)樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)[8]

                1.樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)一般不增殖,可在培養(yǎng)環(huán)境中存活1周或更長時(shí)間。如果細(xì)胞需要持續(xù)培養(yǎng)超過一夜,建議在免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)添加500U/mL GM-CSF和500U/mL IL4,以確保維持DC表型。

                2.樹突狀細(xì)胞在10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β、15ng/mL IL-6和10ug/mL前列腺素E2(Prostaglandin E2)或0.2U/mL肝素(Heparin)和50μg/mL血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)或0.2U/mL肝素(Heparin)中可分化為成熟的樹突狀細(xì)胞。


                2、傳代流程


                貼壁性好的免疫細(xì)胞


                免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之?dāng)U增&培養(yǎng)(四)


                半貼壁性細(xì)胞和懸浮細(xì)胞


                免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之?dāng)U增&培養(yǎng)(四)


                3、凍存與復(fù)蘇[9]


                (1)凍存:在細(xì)胞密度達(dá)到107cells/mL時(shí)可進(jìn)行凍存,采用分步冷凍法。具體步驟如下:

                1.懸浮細(xì)胞500g室溫離心10min收集細(xì)胞沉淀,貼壁細(xì)胞胰酶消化并終止后離心收集;

                2.棄上清,凍存液重懸細(xì)胞沉淀,1mL分裝并做好標(biāo)記;

                3.將凍存管放置-20℃ 1h;-80℃過夜;轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長期保存。


                (2)復(fù)蘇:

                1.從液氮中取出細(xì)胞,37℃水浴快速解凍細(xì)胞;

                2.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有12mL培養(yǎng)基的15mL離心管中;

                3.500g室溫離心5min,棄上清;

                4.加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)。

                Tips:復(fù)蘇的免疫細(xì)胞建議通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,并通過臺(tái)盼藍(lán)染料測定細(xì)胞活力。


                今天講解就到這了,下一個(gè)質(zhì)量優(yōu)化,我們不見不散呀!大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題,歡迎一起交流哦!


                參考文獻(xiàn):

                [1] Gunnlaugsdottir, B., Anti-CD28-induced co-stimulation and TCR avidity regulates the differential effect of TGF- 1 on CD4+ and CD8+ naive human T-cells.International Immunology, 2004. 17(1): p. 35-44.

                [2] Dong, C., Cytokine Regulation and Function in T Cells.Annual Review of Immunology, 2021. 39(1): p. 51-76.

                [3] Nguyen, D.N., et al., Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nature Biotechnology, 2019. 38(1): p. 44-49.

                [4] Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.

                [5] Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency.Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).

                [6] Fang, F., et al., Advances in NK cell production.Cellular & Molecular Immunology, 2022. 19(4): p. 460-481.

                [7] K. Plaisance-Bonstaff, C.F., D. Wyczechowska, et al., Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes.J Vis Exp, 2019(154): p. 10.3791/59967.

                [8] Boudewijns, S., et al., Autologous monocyte-derived DC vaccination combined with cisplatin in stage III and IV melanoma patients: a prospective, randomized phase 2 trial.Cancer Immunology, Immunotherapy, 2020. 69(3): p. 477-488.

                [9] Raulf, M., T Cell: Primary Culture from Peripheral Blood, in Allergy. 2019. p. 17-31.

                本期小愛推薦


                貨號(hào)

                品名

                規(guī)格

                abs9772

                免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

                1L

                abs04045

                Recombinant Human IL-2 Protein

                10ug/50ug/100ug

                abs160019

                CD3/CD28磁珠

                1.5mL×4/1.5mL×8

                abs972

                胎牛血清(優(yōu)級(jí))

                500mL

                abs9244

                青霉素-鏈霉素溶液(100×,雙抗)

                100mL

                abs04123

                Recombinant Human IFN-γ Protein

                10ug/50ug/100ug/500ug/1mg

                abs04698

                Recombinant Human IL-4 Protein

                10ug/100ug/500ug

                abs04079

                Recombinant Human IL-13 Protein(C-6His)

                10ug/50ug/500ug/1mg

                abs7011

                25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(50mL,透氣蓋)

                200個(gè)/箱

                abs7033

                細(xì)胞培養(yǎng)板(標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板)

                50個(gè)/箱

                abs7054

                25mL一次性血清移液管

                200支/箱





                Absin產(chǎn)品線:

                爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測);細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

                特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

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