蛋白純化小白入門總集篇！手把手教你如何設(shè)計(jì)純化實(shí)驗(yàn)

蛋白純化是生物實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之一，隨著商業(yè)蛋白產(chǎn)品的價(jià)格越來越高以及實(shí)驗(yàn)可能用到的蛋白量越來越大，或者課題想要的蛋白沒有商品化的蛋白可以購(gòu)買，自己純化蛋白往往是一個(gè)高效而經(jīng)濟(jì)的選擇。如果你對(duì)于純化實(shí)驗(yàn)還沒有真正接觸過，沒關(guān)系，你可以按照以下的步驟開始你的實(shí)驗(yàn)。 

PART1：對(duì)你的蛋白做一個(gè)基本的了解

在純化實(shí)驗(yàn)開始之前，首先你需要對(duì)你的蛋白和純化的目標(biāo)做一個(gè)初步的了解。

1、你的蛋白純化后準(zhǔn)備用來做什么？

這個(gè)問題常常會(huì)被忽略，蛋白的用途決定了你的純化目標(biāo)，進(jìn)而決定你的純化路線設(shè)計(jì)。如果你對(duì)純度要求不高，往往一步純化就可以解決問題；如果你對(duì)純度要求非常高，那么往往就要用到2步和3步的純化。那我都用3步純化行不行？當(dāng)然不行！純化次數(shù)越多你需要的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本就越高，而且隨著純化步驟的增多，蛋白量也會(huì)有一定的損耗，所以應(yīng)該選擇真正適合的純化路線，可以參考下圖：

2、確定目標(biāo)蛋白的性質(zhì)

在純化之前，你應(yīng)該會(huì)你的目標(biāo)蛋白的性質(zhì)有一定的了解，例如蛋白的分子量，穩(wěn)定性，可溶性，等電點(diǎn)等等。蛋白是不是容易降解，蛋白在緩沖液里是否可以溶解，這些問題往往會(huì)影響到你整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，所以需要多加關(guān)注。另外凝膠過濾層析需要參考蛋白的分子量；離子交換層析需要參考蛋白的等電點(diǎn)；疏水層析需要參考蛋白的疏水性質(zhì)等。

3、確定蛋白的表達(dá)位置

并不是所有的蛋白都表達(dá)后仍停留在細(xì)胞內(nèi)，在純化蛋白時(shí)要充分考慮到蛋白的位置，才能選擇到合適的樣品。如果你的蛋白是胞內(nèi)蛋白，那么只要把細(xì)胞裂解掉之后就可以進(jìn)行純化；如果你的蛋白是分泌蛋白，我們則需要用培養(yǎng)基去上樣；如果你的蛋白是膜蛋白，那么你需要使用去垢劑把蛋白從細(xì)胞膜上面溶解下來。 

PART2：選擇一個(gè)合適的表達(dá)體系（重組蛋白）

如果你是想要短時(shí)間內(nèi)拿到大量的蛋白，而不是僅僅想從植物體或者動(dòng)物體中分離出某些天然蛋白進(jìn)行研究，那么你應(yīng)該選擇先構(gòu)建質(zhì)粒然后在模式細(xì)胞中表達(dá)蛋白，隨著模式細(xì)胞的大量快速繁殖，你可以在短時(shí)間內(nèi)拿到大量的樣品，例如下圖是使用原核表達(dá)體系重組蛋白純化的步驟（具體方法會(huì)在之后的軟文中介紹）：

在純化開始前，選擇一個(gè)合適的表達(dá)體系非常的重要，大家可以根據(jù)自己的蛋白特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)室的條件選擇，如果之前沒有做過純化可以先考慮先從原核表達(dá)起步，或者查看文獻(xiàn)看看其他前輩都用什么表達(dá)體系成功表達(dá)過，不同表達(dá)體系的特點(diǎn)如下表：

PART3：選擇合適的標(biāo)簽（重組蛋白）

作為新手如果想要做重組蛋白純化，一定要在構(gòu)建的載體上加上一個(gè)合適的標(biāo)簽，然后再使用親和層析作為第一步純化往往可以幫你省去大量的時(shí)間和精力。標(biāo)簽的選擇主要是根據(jù)蛋白的特點(diǎn)以及對(duì)純度的要求，新手建議可以從His標(biāo)簽開始做起。

1、His標(biāo)簽：標(biāo)簽小，純化步驟簡(jiǎn)便，純化條件溫和，能純化可溶性/包涵體蛋白，一般不會(huì)影響蛋白的功能結(jié)構(gòu)，且可以產(chǎn)出大量的目標(biāo)蛋白，純度和其他標(biāo)簽相比略低，如果對(duì)純度不是要求特別高的情況下選擇；

2、GST標(biāo)簽：洗脫條件溫和，有助于保持蛋白功能活性，適合pull-down 檢測(cè)，具有很好的線性動(dòng)態(tài)范圍，但分子量較大，需要在純化后去除標(biāo)簽，且不適宜變性環(huán)境；

3、MBP標(biāo)簽：可以減少目標(biāo)蛋白的降解，增加蛋白的表達(dá)量和穩(wěn)定性，提高表達(dá)產(chǎn)物的水溶性，但標(biāo)簽較大，對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)有一定影響；

4、Strep標(biāo)簽：能純化出高純度的目標(biāo)蛋白，純化條件溫和，能進(jìn)行變性條件下的純化。純化柱和填料的價(jià)格和其他標(biāo)簽相比略高。

不同標(biāo)簽的特點(diǎn)如下表：

PART4：選擇合適的純化方法和層析路線

前期做了諸多準(zhǔn)備之后，我們就可以開始選擇純化方法了。常見的純化方法包括親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、多模式層析等等。不同的純化方法可以通過目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的不同的性質(zhì)進(jìn)行分離和純化，有時(shí)候目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)在某一個(gè)特性方面比較接近，可以考慮使用其他的特性去除雜蛋白，所以如果一種純化方法不能達(dá)到理想的純度，可以考慮使用多種方法聯(lián)用。

不同的純化方法的介紹如下：

1、親和層析：利用目標(biāo)蛋白上面的標(biāo)簽特性對(duì)蛋白進(jìn)行純化。根據(jù)蛋白所帶的標(biāo)簽選擇對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的預(yù)裝柱和填料即可（例如蛋白帶有His標(biāo)簽，則選擇His標(biāo)簽預(yù)裝柱和填料）。親和層析具有載量高，快速分離的特點(diǎn)，是重組蛋白純化第一步的選擇；

2、凝膠過濾層析：利用目標(biāo)蛋白和雜蛋白的分子量大小的差異進(jìn)行純化。一般目標(biāo)蛋白和雜蛋白的分子量相差一倍以上，可以達(dá)到比較好的純化效果。因?yàn)槟z過濾層析的特性，它也常常被用來分離蛋白多聚體，也是在結(jié)構(gòu)生物學(xué)純化中對(duì)親和層析的很好的補(bǔ)充；

3、離子交換層析：利用目標(biāo)蛋白和雜蛋白的帶電性質(zhì)的差異進(jìn)行純化。在同樣PH的緩沖液中，由于目標(biāo)蛋白和雜蛋白的等電點(diǎn)有差異，帶有的電荷正負(fù)性和帶電量都會(huì)有所不同。離子交換層析具有高分辨率的特點(diǎn)，可以用來很好的補(bǔ)充并提高樣品的純度。另外，如果樣品沒有標(biāo)簽，可以選擇離子交換層析作為第一步純化；

4、疏水層析：利用目標(biāo)蛋白和雜蛋白的疏水性質(zhì)的差異進(jìn)行純化。如果以上的方法還是無法去除雜蛋白，可以嘗試使用疏水層析；

5、多模式層析：結(jié)合了多種層析模式的特點(diǎn)?？梢宰鳛橐陨戏椒ê芎玫难a(bǔ)充。

如何搭配層析方法？

在搭配層析方法時(shí)，使用CIPP策略。盡量不要將兩種方法連續(xù)使用，盡量避免不同方法之間的樣品處理，也要在樣品純度和得率之間找到平衡。CIPP原則的純化策略如下圖：

PART 5 如何對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行檢測(cè)？

蛋白純化完之后，我們需要對(duì)純化出來的蛋白進(jìn)行檢測(cè)看是否達(dá)到純化的要求。

1、檢測(cè)蛋白特異性：可以使用WB和質(zhì)譜的方法；

2、檢測(cè)蛋白純度：跑SDS-PAGE膠，然后用考馬斯亮藍(lán)染色后觀察；

3、檢測(cè)蛋白量：用紫外吸光光度法，BCA法或者考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度；

4、檢測(cè)均一性：凝膠過濾層析檢測(cè)是否有多聚體；

5、檢測(cè)活性：使用活性檢測(cè)試劑盒。

檢測(cè)示例：

部分熱賣產(chǎn)品

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...