流式細胞術從零開始說

流式細胞術(flow cytometery)是利用流式細胞儀(flow cytometer)對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒等進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析信息全面、分選純度高、方法靈活等特點，可用于細胞大小、細胞顆粒度、DNA及RNA含量、蛋白質含量、細胞特異抗原、細胞活性、胞內(nèi)PH值、細胞周期、細胞凋亡、細胞功能分析等的檢測。

通過流式細胞術進行細胞凋亡分析

abs50001 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒

FITC Annexin V染色的流式細胞術分析。 Human PBMC用12uM喜樹堿處理4h。將細胞與FITC Annexin V在含有碘化丙啶(PI)的緩沖液中孵育，并通過流式細胞術進行分析。經(jīng)過2h的處理，主要有三組細胞：活細胞（FITC Annexin V和PI陰性）和凋亡早期（FITC Annexin V陽性和PI陰性）和FITC Annexin V和PI雙陽性的細胞。

流式細胞術的基本原理

深入了解流式細胞術的基本原理，必須了解流式細胞儀，流式細胞儀的基本元件包括液路系統(tǒng)、光路系統(tǒng)以及電子系統(tǒng)三個部分。

液路系統(tǒng)：確保細胞單個排列通過，每次分析一個細胞；

光路系統(tǒng)：產(chǎn)生、收集、分離和轉換光信號，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供基礎；

電子系統(tǒng)：處理和保存由光學系統(tǒng)檢測到的信號，并將這些信號轉換為可用于分析的數(shù)字數(shù)據(jù)。

液路系統(tǒng)

液路系統(tǒng)的作用是將樣品排列成單列細胞/顆粒流，并使細胞/顆粒穩(wěn)定高速的通過流式細胞儀的檢測點，主要包含流動室+鞘液+廢液+上樣器+壓力控制系統(tǒng)

● 上樣速度越高，樣本中心液流(sample core)越粗，激光聚焦越差，分辨率越低；

● 定性測量一般對流速要求不高，例如免疫分型；

● 定量測量嚴格要求低速，例如細胞周期檢測。

流式細胞中的光信號

1、散射光信號

散射光信號是細胞的固有參數(shù)，不需要使用熒光標簽；

● 前向散射光(forward scatter)：FSC信號的強弱與細胞的大小相關；

● 側向散射光(side scatter)：SSC信號的強弱與細胞內(nèi)的顆粒多少相關；

● FSC-SSC的作用：利用細胞大小和顆粒度初步區(qū)分細胞群、去除細胞碎片、去除黏連細胞。

從細胞進入激光照射區(qū)到離開，產(chǎn)生一個電脈沖信號。H是脈沖高度，代表脈沖信號的峰值；W是脈沖寬度，是指細胞通過激光照射區(qū)域的時間；A是脈沖信號的面積。

實際操作中，部分細胞與細胞會粘在一起，連續(xù)通過激光照射區(qū)，被儀器認定為一次信號，對我們最終的數(shù)據(jù)分析造成干擾。當粘連體出現(xiàn)測量高度不變，寬度和面積變?yōu)閮杀叮闯霈F(xiàn)FSC-Height不變，F(xiàn)SC-Area和Width增大的現(xiàn)象。

我們可以使用FSC-A與FSC-H來排除粘連體，正常單細胞通過流式細胞儀激光照射區(qū)時，H和A是成正比增大的，而粘連體通過時，H不變，A增大，因此，可通過細胞的FSC-A(Area)與FSC-H(Height)參數(shù)wan美排除掉粘連體，也可以通過FSC-H與FSC-W來操作，但此種方法對于復雜樣本（樣本中各種細胞大小差異較大）不太適用，實際上，去除粘連體的重要步驟在樣本制備階段。

2、熒光信號

在流式細胞術中，熒光信號的產(chǎn)生是由于特定的熒光素分子吸收一定波長的光后躍遷到激發(fā)態(tài)，然后釋放光子（熒光）回到基態(tài)。了解熒光信號的產(chǎn)生以及各部分元件，有助于我們多色配色。

激光：提供單色光束，用于激發(fā)細胞中的熒光標記物，常見激光器有355nm（紫外）、405nm（紫色）、488nm（藍色）、561nm（黃綠色）、633nm（紅色）。有的流式細胞儀只配備488nm；有的流式細胞儀配備兩種激光器如488nm與638nm。多色流式則可能需要更多的激光器。

濾光片：通常包括帶通濾光片、長通濾光片、短通濾光片，帶通濾光片。帶通濾光片允許一個固定范圍內(nèi)波長的光通過。如BP530/30表示允許波長515nm-545nm范圍的光通過，長通允許特定波長以上的光通過，特定波長以下的光不能通過。短通濾光片使特定波長以下的光通過。

分光棱鏡：將激光器發(fā)出的光線和細胞散射或熒光發(fā)射出來的光線分開，確保不同顏色的熒光可以被不同的檢測器準確地捕捉到。

熒光信號檢測器：檢測分光棱鏡分離出的熒光信號。每個檢測器對應一個特定的熒光波長，用于測量細胞中特定熒光標記物的強度。

電子系統(tǒng)

主要負責處理和數(shù)字化由光學系統(tǒng)檢測到的光信號

放大：當細胞或顆粒通過檢測點時，激光束照射到它們上產(chǎn)生的光信號（包括前向角散射(FSC)、側向散射(SSC)和熒光信號）被光電倍增管(PMT)或光電二極管(PD)探測到，并轉化為電信號。這些初始的電信號通常很弱，需要通過信號放大器進行放大。

模數(shù)轉換(ADC)：放大后的電信號通過模數(shù)轉換器(ADC)轉化為數(shù)字信號。ADC的位數(shù)（如14到24位）決定了信號的解析率和能轉化的數(shù)值范圍。

脈沖分箱(Pulse Processing)：每個細胞的所有參數(shù)的電壓脈沖會被進行分箱，即按照一定的采樣率和ADC的解析率，將模擬信號轉換為數(shù)字信號，并存儲為數(shù)據(jù)以備后續(xù)分析。

數(shù)據(jù)存儲與分析：數(shù)字信號被傳送到電腦，存儲為數(shù)據(jù)文件，以備分析。這些數(shù)據(jù)文件通常以標準的流式細胞儀文件格式輸出，如FSC數(shù)字數(shù)據(jù)文件。

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