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                腸道固有層免疫細(xì)胞分離制備指南

                更新時(shí)間:2025-02-13      點(diǎn)擊次數(shù):505

                1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

                 

                試劑準(zhǔn)備

                 

                40% Percoll溶液配制:

                Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合,配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比4:6混合,配制40%等滲Percoll溶液。

                 

                80% Percoll溶液:

                Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合,配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比8:2混合,配制80%等滲Percoll溶液。

                 

                2、腸道固有層免疫細(xì)胞分離步驟操作步驟

                 

                1)頸椎脫臼法處死小鼠并固定在手術(shù)臺(tái)上,75%酒精消毒小鼠腹部,于正中縱行剪開暴露腹腔;

                2)如下圖所示,在小鼠胃與十二指腸連接處剪斷,一邊分離小腸周圍脂肪組織和腸系膜,一邊拉出小腸,之后在小腸和盲腸連接處剪斷,從而分離出小腸。

                 

                小鼠腸道組織解剖圖

                 

                3)10cm培養(yǎng)皿中加入5mL 4°C預(yù)冷的PBS,將步驟2中的小腸放入培養(yǎng)皿潤(rùn)洗,使用鑷子和剪刀依次去除脂肪組織和派伊爾結(jié)。

                 

                小鼠派伊爾結(jié)去除操作圖

                 

                A. 去除表面脂肪和腸系膜等組織的小腸,紅色箭頭指示派氏結(jié)(平均每只小鼠有6-9個(gè)派氏結(jié));

                B. 剪去派氏結(jié)的操作示意圖;

                C. 去除派氏結(jié)后的小腸,紅框是所有剪下來的所有派氏結(jié)。

                小鼠派伊爾結(jié)(Peyer's patches, PPs)是小鼠腸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分,主要分布在小鼠小腸的下部,即遠(yuǎn)端空腸和回腸,與小鼠固有層免疫細(xì)胞的組成和功能有顯著差異,在分離小鼠腸道免疫細(xì)胞時(shí),去除派伊爾結(jié)是為了確保獲得更純凈、更具代表性的目標(biāo)細(xì)胞群體,從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

                 

                4)將小腸切成4段,用剪刀縱向剪開小腸(不必沿著腸系膜方向),暴露出腸內(nèi)容物,輕輕地將腸內(nèi)容物從粘膜表面刮除;

                5)將小腸轉(zhuǎn)移到含有10mL HBSS + 2%FBS的50mL離心管中,劇烈渦旋10-20s;

                6)用鑷子取出小腸重復(fù)清洗2次;

                7)將清洗過的腸組織,剪碎成0.5cm的小片段,將組織塊(100-200mg)轉(zhuǎn)移到2mL圓底管中,加入1mL小鼠腸道組織解離液(abs50093),37°C水平搖床輕輕搖晃孵育60min(根據(jù)組織糜爛狀態(tài)適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間);

                8)從水平搖床中取出圓底管,劇烈渦旋10-20s,通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)(abs7232)過濾,用10mL PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng);

                9)收集含有細(xì)胞的濾液到50mL管中,20°C下400g離心5min,棄上清液,用 4 mL 40% percoll(abs9102)重懸細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管;

                10)吸取 2.5 mL 80% percoll 深入到 15 mL 離心管底部,試管稍微傾斜,將 4 mL 40% percoll 與細(xì)胞的混合液沿著管壁緩慢加入離心管,覆蓋在 80% percoll 溶液的頂部形成密度梯度;

                ▲ 注意:不要破壞 80% percoll 和 40% percoll 與細(xì)胞的懸浮液的分界面,40% 和 80% percoll 現(xiàn)配現(xiàn)用。

                11)800 g 20 °C 離心 20 min,升速(ACC)1,降速(DEC)1;

                 

                Percoll 分離組織免疫細(xì)胞示意圖

                 

                注:分離圖片參考自文獻(xiàn) DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327

                 

                12)離心結(jié)束后,吸取中間白膜層免疫細(xì)胞至新的 15 mL 離心管中,加入 3 倍體積 4°C 預(yù)冷 PBS,上下顛倒混勻,4 °C 下 400 g 離心 5 min,棄上清;

                13)按照步驟 12 重復(fù)清洗一次,棄上清得到腸道固有層淋巴細(xì)胞;

                14)細(xì)胞染色緩沖液(abs9475)重懸細(xì)胞沉淀,并調(diào)整細(xì)胞濃度至 5-10×106 cells/mL,將 100 μL/管的細(xì)胞懸液分配到 12×75 mm 的流式管(abs7303)中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

                 

                3、流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

                 

                 

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                abs9474

                組織保存液

                100mL

                保存組織

                abs50093

                小鼠腸道組織解離試劑盒

                25T

                消化組織酶

                abs9102

                細(xì)胞分離液

                100mL

                富集細(xì)胞

                abs7232

                70um 細(xì)胞篩網(wǎng)

                100 個(gè)

                篩網(wǎng)

                abs7303

                5mL 流式管(無菌無酶,帶帽)

                500 個(gè)

                流式管

                abs9475

                細(xì)胞染色緩沖液

                500mL

                染色緩沖液




                 

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                貨號(hào)

                產(chǎn)品名稱

                規(guī)格

                abs9907

                流式絕對(duì)計(jì)數(shù)管

                50T

                abs9477

                小鼠 Fc 受體阻斷劑

                200T/500T

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                人 Fc 受體阻斷劑

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                abs9488

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                150mL

                abs7303

                5mL流式管(無菌無酶,帶蓋)

                1箱

                abs1840002

                APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9)

                25T/100T

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                FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4)

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                Absin產(chǎn)品線:

                爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

                特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

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