如何檢測(cè)脫氧核糖核酸酶I的活性？

一、熒光法

原理：

熒光法利用熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光的特性。當(dāng)DNase I降解雙鏈DNA時(shí)，熒光強(qiáng)度會(huì)降低，通過測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化可以定量DNase I的活性。

操作步驟：

準(zhǔn)備反應(yīng)體系：

在反應(yīng)體系中加入雙鏈DNA底物（如小牛胸腺DNA或環(huán)狀雙鏈DNA）、熒光染料（如Picogreen）以及不同濃度的DNase I標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品。

孵育反應(yīng)：

在適宜的溫度（如37℃）下孵育一定時(shí)間（如5-20分鐘），使DNase I充分降解DNA。

終止反應(yīng)：

通過加熱（如65-75℃）或其他方法終止反應(yīng)。

測(cè)量熒光強(qiáng)度：

使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算活性：

以DNase I濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的DNase I活性。

優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高，可檢測(cè)低至皮摩爾級(jí)別的DNase I活性。

操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

適用于高通量篩選。

二、紫外分光光度法

原理：

DNase I降解DNA會(huì)導(dǎo)致溶液在260nm處的吸光度增加（增色效應(yīng)）。通過測(cè)量反應(yīng)前后溶液在260nm處的吸光度變化，可以計(jì)算DNase I的活性。

操作步驟：

準(zhǔn)備反應(yīng)體系：

在反應(yīng)體系中加入DNA底物和不同濃度的DNase I標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品。

孵育反應(yīng)：

在適宜的溫度下孵育一定時(shí)間，使DNase I充分降解DNA。

測(cè)量吸光度：

使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量反應(yīng)前后溶液在260nm處的吸光度。

計(jì)算活性：

根據(jù)吸光度的變化值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線或公式計(jì)算DNase I的活性。

優(yōu)點(diǎn)：

操作簡(jiǎn)便，無需特殊試劑。

適用于初步篩選和快速檢測(cè)。

缺點(diǎn)：

靈敏度相對(duì)較低，可能無法準(zhǔn)確檢測(cè)低活性的DNase I樣品。

受溶液中其他物質(zhì)的影響較大。

三、凝膠電泳法

原理：

通過凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，觀察DNA的降解情況來判斷DNase I的活性。活性越高的DNase I樣品，DNA降解程度越明顯。

操作步驟：

準(zhǔn)備反應(yīng)體系：

在反應(yīng)體系中加入DNA底物和不同濃度的DNase I標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品。

孵育反應(yīng)：

在適宜的溫度下孵育一定時(shí)間，使DNase I充分降解DNA。

終止反應(yīng)并處理樣品：

加入終止液終止反應(yīng)，并取適量反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

電泳分析：

將樣品加載到凝膠上，進(jìn)行電泳分離。使用紫外燈或染色劑觀察DNA條帶。

判斷活性：

根據(jù)DNA條帶的降解程度判斷DNase I的活性。

優(yōu)點(diǎn)：

可直觀觀察DNA的降解情況。

適用于定性分析。

缺點(diǎn)：

操作繁瑣，耗時(shí)較長。

靈敏度較低，定量不準(zhǔn)確。

受電泳條件、凝膠濃度等因素的影響較大。