快速內切酶SpeI

愛必信的快速內切酶是一系列經過基因工程重組、能夠在5~15分鐘內精確完成DNA切割的限制性內切酶，適用于質粒DNA、PCR產物或基因組DNA等的快速酶切。愛必信的快速內切酶具有如下特點：5~15分鐘內即可完成酶切；共用一種酶切Buffer，大大簡化酶切反應體系；良好的酶活冗余度，輕松應對底物過量或困難模板酶切。此外，愛必信生物去磷酸化、連接試劑在配套的Buffer中具有100%活性，支持一管化反應，提升“酶切-修飾-連接"的體驗。
識別位點：
5'...A ↓ C T A G T...3'
3'...T G A T C ↑ A...5'
同裂酶：AhlI，BcuI
注：同裂酶對于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

快速內切酶SpeI產品組分：

1. 快速內切酶SpeI  DNA 快速酶切流程：
① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應體系：

a. 本體系適用于經過純化的 PCR 產物酶切。未純化的 PCR 產物具備一定的離子強度，10× Cut Buffer 加入量可適當減少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同時具有外切酶活性，會影響酶切產物，因此如下一步需進行克隆等操作，建議酶切前對 PCR 產物進行純化。
② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；
③ 37℃溫育 15 min（質粒），或 15~30 min（PCR 產物），或 30~60 min（基因組 DNA）；
④ 80℃溫育 20 min 即可使酶失活，停止反應（可選）。
2. 雙酶切或多酶切：
① 每種快速內切酶的用量為 1 μl，并根據需要適當擴大反應體系；
② 所有快速內切酶的體積總和不得超過總反應體系的 1/10；
③ 如果所用的幾種快速內切酶的最適反應溫度不同，應先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應溫度下進行酶切反應。
3. 適用于質粒的擴大反應體系：
注：如果總反應體系大于 20 μl，應適當增加溫育時間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位點數量：

甲基化修飾影響：

在不同反應緩沖液中的活性：

-20℃，有效期2年。

建議反應條件：
1× Cut 緩沖液；
37℃溫育；
參照“DNA 快速酶切流程"配制反應體系。
失活條件：
80℃溫育 20 min。
質量控制：
功能活性檢測：
最適反應溫度下，在 20 μl 反應體系中，1 μl SpeI 能夠在 15 min 內*消化 1 μg pUC19-SpeI DNA。
超長時間溫育檢測：
最適反應溫度下，將 1 μl SpeI 與 1 μg pUC19-SpeI DNA 共同溫育 3 h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解，延時酶切可能出現星號活性。
酶切 - 連接 - 再酶切檢測：
最適反應溫度下，使用 1 μl SpeI 消化底物，回收酶切產物。在 22℃下使用適量 T4 DNA Ligase(Fast) 可以將酶切產物重新連接。將連接產物再次回收后，使用相同的內切酶可以重新切開連接產物。
非特異性內切酶活性檢測：
最適反應溫度下，將 1 μl SpeI 與 1 μg 超螺旋質粒DNA 共同溫育 4 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質粒 DNA 仍然處于超螺旋狀態(tài)。
藍白斑檢測：
將含有單一 lacZα 基因的載體以 1 μl SpeI 消化，重新連接后轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布在含有對應抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB 培養(yǎng)基平板上。連接正確的產物會生長出藍色菌落，而連接錯誤（即 DNA 末端切口不完整）的產物將得到白色菌落。對于愛必信的系列限制酶而言，白色菌落比例應小于 1%。