PM原代細(xì)胞核酸轉(zhuǎn)染試劑盒

產(chǎn)品介紹：

    PM原代細(xì)胞核酸轉(zhuǎn)染試劑盒是專門用于核酸原代細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染的試劑盒。它具有非常好的轉(zhuǎn)染性能，可高效轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá) 85%以上（EGFP 質(zhì)粒）。其功能強(qiáng)大，不僅可高效轉(zhuǎn)染較大分子的質(zhì)粒 DNA，還可高效轉(zhuǎn)染 mRNA、siRNA、mimics 和各種小分子 DNA。與目前市場上常見的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不同，它采用生物可降解材料配制，對細(xì)胞的毒性很低，轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)細(xì)胞幾乎無明顯死亡。使用也非常方便，先將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒 DNA 混合，再將轉(zhuǎn)染試劑-DNA 復(fù)合物直接加入培養(yǎng)細(xì)胞中，血清不影響其轉(zhuǎn)染效果，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液，操作十分簡便。 

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、強(qiáng)大的細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能：可高效轉(zhuǎn)染多種原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率在原代細(xì)胞中可高達(dá)85%以上；

2、轉(zhuǎn)染功能強(qiáng)大，不僅可高效轉(zhuǎn)染大分子質(zhì)粒DNA，還可高效轉(zhuǎn)染mRNA、siRNA、mimics和各種小分子DNA；

3、極低的細(xì)胞毒性：使用可降解生物材料，細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%，大大降低了因細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；

4、操作簡便，可用于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前后不需要更換培養(yǎng)液。

操作步驟：

一、質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染（以24 孔板轉(zhuǎn)染為例）:

A、細(xì)胞接種:

1、 轉(zhuǎn)染前一天對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每孔接種0.8-1.2×10 5 個(gè)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為90%左右，且生長良好（非常重要）；

2、 最好在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營養(yǎng)不足導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

B、PM /DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備(該步完成后應(yīng)立即進(jìn)行轉(zhuǎn)染):

1、在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，再加入適量的PM轉(zhuǎn)染試劑，見附表。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2、 在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，并加入適量的溶液A，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見附表。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3、將DNA-培養(yǎng)基混合物滴加至PM-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15-20分鐘后，立即轉(zhuǎn)染。注意： PM-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。

注意：離心管最好使用聚丙烯離心管。

C、轉(zhuǎn)染:

1、 將步驟B制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以使復(fù)合物均勻分布。加完后，立即將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.、培養(yǎng)12小時(shí)后即可觀察，最佳觀察或收獲時(shí)間為24-48小時(shí)。

3、PM在培養(yǎng)基中仍有較高的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無血清或低血清培養(yǎng)基。

二、siRNA 轉(zhuǎn)染（以24 孔板轉(zhuǎn)染為例）:

A、 細(xì)胞接種:

1、轉(zhuǎn)染前一天對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為30-50%左右，且生長良好、無支原體污染（非常重要）；

2.、最好在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營養(yǎng)不足導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

B、PM /siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備 (該步完成后應(yīng)立即轉(zhuǎn)染):

1、 在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，并添加適量的PM轉(zhuǎn)染試劑(見下表) 。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2、在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，并添加適量的siRNA（見下表），用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3、將siRNA-培養(yǎng)基混合物滴加至 PM-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15-20分鐘后，立即轉(zhuǎn)染。

C、轉(zhuǎn)染:

1、將步驟B制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板。加完后，立即將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2、37°C培養(yǎng)24-72小時(shí)，檢測基因抑制效果。如果需要，細(xì)胞培養(yǎng)4-6小時(shí)可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。

3、 PM 在培養(yǎng)基中仍有較高的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無血清或低血清培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng)：

1、 剛開始轉(zhuǎn)染，請務(wù)必進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，如24孔板質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔質(zhì)粒用量0.8 ug， PM可選擇2.0 ul、2.5 ul、3.0 ul、3.5 ul進(jìn)行優(yōu)化。24孔板siRNA轉(zhuǎn)染，PM 用量2.0 ul，siRNA用量可選10 pmol、20 pmol、30 pmol、40 pmol進(jìn)行優(yōu)化。

2、進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)以確保轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度在80-90%為準(zhǔn)，過高或過低均會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)以確保轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度在30-50%為準(zhǔn)。在制備DNA或siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)，應(yīng)避免體系中存在血清（推薦DMEM）。培養(yǎng)體系中盡量不要添加抗生素，抗生素會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞死亡。

3、溶液A僅用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，RNA或siRNA轉(zhuǎn)染不需加入溶液A。

4、 請注意質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)對細(xì)胞密度和轉(zhuǎn)染試劑用量等條件的差異，不要混用同一條件。

5、 如果需要質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)，請?jiān)谵D(zhuǎn)染24-48小時(shí)后加入篩選培養(yǎng)基。

6、 本產(chǎn)品適合于質(zhì)粒DNA、siRNA分別獨(dú)立轉(zhuǎn)染，如需質(zhì)粒DNA、siRNA共轉(zhuǎn)，請選用核酸共轉(zhuǎn)染試劑（abs60317）。

附表 1： 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉(zhuǎn)染條件

附表 2：siRNA 轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉(zhuǎn)染條件

儲(chǔ)存/保存方法：

-20°C 避光保存，有效期一年，使用前請輕輕混勻。

試劑盒組成：

產(chǎn)品用途：

適用細(xì)胞系 ：小鼠軟骨細(xì)胞，大鼠軟骨細(xì)胞，人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，人肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，小鼠肺成纖維細(xì)胞，人肺癌上皮細(xì)胞，人乳腺癌上皮細(xì)胞，人結(jié)腸癌細(xì)胞，人氣管上皮細(xì)胞， 人肝癌細(xì)胞，人宮頸癌上皮細(xì)胞，前列腺癌上皮細(xì)胞，大鼠肺靜脈平滑肌細(xì)胞，人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，大鼠心肌細(xì)胞，人纖維肉瘤細(xì)胞，大鼠骨骼肌細(xì)胞，人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞， 人黑色素瘤細(xì)胞，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，小鼠肝癌細(xì)胞，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞等等