AO/PI雙染試劑盒

描述：

AO/PI雙染試劑盒是采用 AO/PI 探針雙染細胞核的方法檢測凋亡細胞的狀態，是細胞凋亡形態學研究常用的染色方法。吖啶橙（Acridine Orange，AO）為一種具有細胞膜通透性的熒光染料，該染料能透過活細胞膜，使核 DNA 和 RNA 染色。它與細胞中 DNA 和 RNA 結合量存在差別，復合物可發出不同顏色的熒光，AO 與 dsDNA 結合時發出綠色熒光，而與 ssDNA 和 RNA 結合時發出紅色熒光。當與 DNA 結合時，它與熒光素在光譜上非常相似，激發最大值為 502nm，發射最大值為 525nm（綠色）。當它與 RNA 結合時，激發最大值移至 460nm（藍色），發射最大值移至 650nm（紅色）。

在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；而在凋亡細胞中，因染色質固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒；而壞死細胞黃熒光減弱甚至消失。Propidium Iodide 是一種 DNA 結合性染料，其激發和發射波長分別為 488nm 和 630nm，產生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞。因此，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞不能著色，早期凋亡細胞呈微弱紅光，晚期凋亡細胞紅光加強，壞死細胞呈強紅色熒光。

應用：

流式細胞儀；激光共聚焦；熒光顯微鏡

使用方法：

1、試劑準備：
PBS 緩沖液（pH7.4）或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

2、耗材準備
離心管、吸頭、一次性手套

3、染色工作液配制：
（1） 根據樣品數，按下列比例配制染色緩沖液。 取 100μL 試劑 C 用 900μL 純水稀釋，充分混勻即成染色緩沖液。
（2）每 500μL 染色緩沖液加入 5ul AO 染色液和 10ul PI 染色液，充分混勻，即成染色工作液。

4、懸浮細胞染色
（1）收集樣本細胞，細胞數量在 10X105 個以內。
（2）用 PBS 洗滌細胞兩次。
（3）用 500μL 染色工作液將細胞重懸。
（4）輕輕混勻后 4℃避光孵育 10-20 分鐘。
（5）用 PBS 洗滌細胞。
（6）用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測結果。

5、貼壁細胞原位染色
（1）用 PBS 洗滌細胞 2 次。
（2）細胞培養板中或細胞爬片上加入適量體積的染色工作液。
（3）37 ℃孵育細胞 10～20 分鐘，不同的細胞最佳培養時間不同。可以用 20 分鐘作為起始孵育時間，之后優 化體系以得到均一的標記結果。
（4）吸干染色工作液，用培養基洗培養板或蓋玻片 2～3 次，每次用預熱的培養基覆蓋所有細胞，然后吸干培養基。

結果分析 ：
在熒光顯微鏡下，選用 488nm 激發光鏡檢：
AO 染色正常細胞 DNA 呈均勻黃色或黃綠色，形態結構正常。
當細胞凋亡時，染色質濃縮，細胞核碎裂成點狀，被染成大小不一、致密濃染。
壞死細胞呈強紅色熒光。

注意事項：

1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
2、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。
3、本染色試劑盒可用于細胞、細胞涂片等。以下以懸浮培養細胞的熒光顯微鏡檢測為例，其他方法請參閱相關資料。
4、貼壁細胞可以消化下來染色，也可以直接原位染色。