鼠尾膠原—細胞的松軟“席夢思”

膠原蛋白是結締組織和內臟器官細胞外基質的主要構造成分，在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結構上膠原蛋白分為許多類型。

膠原蛋白I（Collagen, Type I）是由2個α1 鏈和1個α2 鏈組成的異源多聚體（圖1），在37℃，中性pH 下自發形成三螺旋骨架，是一種優秀的細胞培養用基質，廣泛用于肝細胞、成纖維細胞、脊神經節、肌肉細胞、施萬細胞、胚肺細胞、上皮細胞和其他大量細胞系。還能用于研究細胞生長、分化、遷移以及發育過程中的組織形態發生。

圖1 膠原蛋白I分子模型

鼠尾膠原蛋白I 是根據Birkedal-Hansen 方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。可用于包被細胞培養器皿，培養細胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養器皿表面不易貼壁的細胞，比如成纖維細胞、肝細胞等原代細胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實的生長環境，使得細胞在三維環境中生長。

本品為溶于6mM HAc 的無菌溶液（圖2），濃度5mg/ml，每個批次產品皆通過細胞培養測試（包括三維空間培養）以保證質量的可靠性。接下來我們了解鼠尾膠原蛋白I的兩種用途吧。

圖2 鼠尾膠原蛋白I (abs47014921)

一、細胞培養器皿的表面包被

組織培養器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm²，起始濃度可選5μg/cm²。建議根據具體細胞類型來優化。

1、6mM HAc稀釋液的制備

本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的無菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建議用6mM HAc溶液做進一步稀釋。配制方法：取34.5μl 冰醋酸（17.4M）加入100ml雙蒸水，充分混勻后即得到6mM HAc溶液，0.22μm濾膜過濾除菌后待用。

2、包被步驟

1）根據自身實驗體系以及優化后的包被濃度來計算所需的膠原蛋白量，并加入相應孔內，確保膠原蛋白溶液覆蓋表面。

a. 以包被濃度為 5μg/cm²，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如50μg/ml， 然后參考表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內；

b. 以包被濃度為 2μg/cm²，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如12μg/ml，然后參考表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內；

表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表

2）室溫孵育1h，小心吸掉多余液體，用無菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完膠原蛋白溶液后，在超凈臺內開蓋過夜晾干。無菌條件下，包被好的器皿在4-25°C至少可保存3個月。

二、三維膠原的制備

當鼠尾膠原蛋白I使用濃度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定強度的三維膠，建議成膠濃度為1-2 mg/ml。

由于本品是以溶于6mM HAc的無菌溶液形式提供，在成膠過程需先加入0.06倍體積的0.1M NaOH中和。

1、需要溶液準備（無菌、預冷）

10×細胞培養液（依據培養的細胞種類而定）、0.1M NaOH、無菌水（abs9259）

2、三維膠原制備（不含細胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：

1）取200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的離心管內，加入690μl無菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl  0.1M  NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結】，立即混勻。再加入100μl 10×細胞培養液，混勻后立即加到培養器皿中。【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。

2）將培養器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，轉移到培養箱內。

三維膠原制備（含細胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：

a. 準備好細胞懸液，并放置于冰浴中。b，將200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結】，立即混勻。再加入23μl  10×細胞培養液，立即混勻【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。再加入760μl 的細胞懸浮液，混勻后立即加到培養器皿中。

b. 將培養器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，加入適當體積細胞培養液，轉移到培養箱中培養。

本期講解就到這里了，如有細胞培養問題，歡迎微信公眾號“愛必信生物"后臺留言

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