RIPA裂解液（強）

RIPA裂解液（強）  溶液

一、培養的細胞樣品
1、充分融解RIPA裂解液，之后混勻。取適當量的裂解液，使用前數分鐘內加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最終濃度為1mM。
2、貼壁細胞：吸除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可忽略此步）。按照六孔板的每孔細胞加入150-250ul裂解液的比例加量。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。
懸浮細胞：離心收集細胞，用手指彈散細胞。按照六孔板的每孔細胞加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。
3、充分裂解后，10,000-14,000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、WB和免疫沉淀等實驗。
【裂解液用量說明】：通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經足夠，如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200μl或250μl。
二、組織樣本
1、將組織的剪切成細小的碎片，使用勻漿儀進行勻漿。
2、充分融解RIPA裂解液，之后混勻。取適當量的裂解液，使用前數分鐘內加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最終濃度為1mM。
3、按照每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加量。【注意：如果裂解不充分可以適當添加用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可適當降低用量。】
4、充分裂解后，10,000-14,000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、WB和免疫沉淀等實驗。
5、如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過高強度的漩渦混勻器使樣品裂解充分，之后使用相同步驟操作。直接裂解的優點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解的足夠充分。
【注意】：RIPA裂解液的裂解產物經常會出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散這些透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續實驗。像檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kB、p53，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。

1、裂解樣品的所有步驟都需在冰上或 4℃進行。
2、RIPA 裂解液的裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為
含有基因組 DNA 等的復合物。在不檢測和基因組 DNA 結合特別緊密的蛋白的情況下，可
以直接離心取上清用于后續實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過
超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續實驗。
3、不同的細胞需要加入的裂解液的量可能會不同，需要根據具體條件進行條件篩選；
4、若裂解液產生沉淀或者析出，可在 37℃水浴中孵育，振蕩使沉淀或析出物溶解，若不能
溶解，可適當加熱助溶。
5、為了您的自身安全，使用試劑前，請做好防護，如穿實驗服，帶手套等。

-20℃保存，有效期12個月